骨质疏松症中BMSCs-EVs通过PI3K/Akt信号通路促进成骨分化的研究进展

吴思友，何斌，祝紫兰，梁宁唐小勇

1遵义医科大学第三附属医院（遵义市第一人民医院）骨科，贵州 遵义 563000；2遵义医科大学附属医院整形烧伤科；3遵义市红花岗区人民医院骨科

骨质疏松症（OP）是由多种原因致使骨密度和骨量降低，骨微结构破坏、骨脆性增加，从而导致骨折的全身退行性骨病［1］。OP发病的主要机制是成骨细胞的骨形成和破骨细胞骨吸收之间的不平衡；另外，骨髓间充质干细胞（BMSCs）的数量减少和功能衰退亦是导致OP形成机制之一［2］。目前，治疗OP药物主要分为抗吸收、成骨和同时具备双重药理作用的药物，但因药物不良反应而治疗效果欠佳［3］。BMSCs是一种具有自我更新、多向分化潜能的细胞，其多能性成为干细胞治疗的基础；在特定条件下具有向成骨细胞分化的能力，并进一步有益于诱导骨形成［4］。研究表明，BMSCs具有治疗与年龄进展相关退行性疾病的潜力，BMSCs的衰老过程在OP发生、发展中起重要作用［5］。细胞外囊泡（EVs）是细胞分泌组成的一部分，通过介导细胞间信使通信传递和细胞生物学效应发挥功能作用。来源于BMSCs的EVs（BMSCs-EVs）生物学特征、功能与BMSCs类似，其中包括组织修复、诱导成骨、促进血管新生和骨矿化聚集作用［6］。因此，BMSCs衍生的EVs在治疗OP中发挥重要作用。磷脂酰肌醇3-激酶（PI3K）/蛋白激酶B（Akt）是骨形成关键信号调控通路之一，激活PI3K/Akt具有抵抗骨吸收、促进成骨的作用，其在破骨细胞的分化中起重要作用［7］。研究表明，PI3K/Akt信号通路在骨再生、骨重建、骨代谢调节中起重要作用［8］。PI3K/Akt信号通路不仅在调控间充质干细胞成骨分化中发挥作用，而且还是间充质干细胞诱导向成骨细胞生长、增殖分化和生存周期的关键调节信号。从蛋白质表达组学分析方面来说，源自于细胞不同类型EV中可呈现出不同的蛋白质表达谱，它们通过调节信号通路的效应机制，从而诱导骨形成能力、激活PI3K/Akt信号通路［9］。另有研究表明，源自BMSCs的EVs可能通过IL-1β下调来激活PI3K/Akt信号通路，从而影响成骨细胞分化。由此，BMSCs释放的EVs可能被认为是在骨再生医学中充当干细胞疗法。从微小核糖核酸（microRNA）分析，富含microRNA的BMSCs-EVs被HUVECs内吞，从而抑制PTEN表达并激活PI3K/Akt通路，促进HUVEC增殖分化、迁移归巢和血管新生，最终诱导新骨生成，促进骨再生，因而来自BMSCs衍生EVs的microRNA通过激活PI3K/Akt信号通路在骨再生、血管生成中发挥重要功能［11］。现就OP中EVs通过PI3K/Akt信号通路促进成骨分化的研究进展综述如下。

1 BMSCs-EVs的结构特性及功能

1.1 BMSCs-EVs的特征EVs是几乎所有活细胞分泌的纳米级膜囊泡，质膜通过出芽或细胞内吞作用运输途径形成，EVs通常分为多个类别，最常见的分类据直径大小分为三类：外泌体（40～100 nm）、微泡（MV；100～1 000 nm）和凋亡小体（50～5 000 nm）［12］，EVs富含大量蛋白质、脂质和核酸（mRNA、ncRNA和DNA）等生物活性分子，能快速将细胞间信使传递到邻近细胞或将其携带转移到远处的靶细胞，从而调节受体细胞的各种生理和病理过程。EVs通过在细胞之间相互转移生物活性内容物，通过细胞间通信信息表达联合EVs的骨代谢和骨再生作用，在OP发病机制数量和功能代谢中发挥重要作用［13］，EVs一旦与成骨细胞膜上表达的RANKL相结合，激发骨形成相关信号通路，诱导成骨样细胞和骨钙结节沉积能在间充质干细胞上刺激成骨分化。

研究表明，BMSCs-EVs中含有许多蛋白质、脂质、信使RNA和microRNA等生物活性分子，在不同的生物学过程中发挥重要作用。还可稳定表达识别EVs蛋白的特异性表面标志物，即CD9、CD63、CD81，BMSCs-EVs具有独特优点［14］，如快速传递性、无免疫原性、内在归巢效应、无致癌性、无伦理争议、易获取和储藏等，其在多种骨骼肌肉系统疾病中具有巨大治疗潜力。BMSCs-EVs具有诱导成骨、促进骨再生、血管生成和骨矿化作用，BMSCs-EVs的无细胞疗法是一种有前景的骨再生方式。然而，BMSCs-EVs的骨代谢研究仍处于早期阶段。据报道，MSC-EVs可通过增强成骨细胞的活性和促进血管生成来诱导新骨形成，尤其是在OP治疗方面的潜力，从RNA或蛋白质角度分析，有未经修饰的RNA及蛋白表达的MSC-EVs仅显现出中等治疗效果，修饰的RNA及蛋白表达的MSC-EVs显现出较好治疗效果，由此可见，富含RNA或蛋白质的基因治疗技术工程MSCs可能会增强MSC-EVs的成骨能力来诱导新骨形成［15］。因此，应用含有RNA或蛋白质的BMSCs-EVs具有明显促进成骨的特性。

1.2 BMSCs-EVs的功能MSCs能分泌多种EVs以保持组织内环境稳态维持正常的功能，MSC-EVs携带大量核酸、蛋白质和脂质，以及丰富的miRNA，可将这些生物活性分子快速输送到受体细胞中，从而使MSC-EVs在无细胞治疗中得到合理应用［16］。从BMSCs-EVs的miRNA方面分析，蕴含BMSCs-EVs的多种miRNA（如miR-27a）可能通过Wnt/β-catenin信号通路传导修饰BMSCs-EVs中的特定miRNA来调节成骨细胞分化，有效激活Wnt/β-catenin以促进骨形成［17］。由于BMSC-EVs富含多种miRNAs，不同miRNAs之间可能存在复杂的相互调节影响。据报道，MSC-EVs可通过增加骨形成、减少骨髓脂肪堆积和骨吸收来防止OP的骨丢失并维持骨强度，同时BMSCs-EVs含有更多的促分化和趋化蛋白，它们能促进骨和软骨组织的生长，为靶向治疗应用选择合适的EVs种属和供体的重要性，从蛋白质含量和功能作用方面呈现出不同的特征［18］。OP病理机制改变细胞的EVs不同地影响BMSC衰老代谢和骨形成方面的成骨标志物表达。因此，不应忽略组织或细胞微环境，因为它们可能会抵抗EVs治疗的预期效果。此外，我们认为细胞的种属和供体的年龄是重要因素，应用MSC衍生的EVs可能有利于治疗年龄相关的骨代谢性疾病［19］。近年来，BMSCs-EVs已被作为纳米载体用于慢性骨病研究中，BMSCs-EVs的蛋白表达谱分析显示，适当修饰BMSCs中的功能蛋白，使其富含内源性活性分子的BMSCs-EVs蛋白表达，从而促进成骨或抑制破骨细胞生成［20］。尽管BMSCs-EVs在治疗骨代谢疾病中具有巨大潜力，但仍有不足之处，如BMSCs-EVs的纯化、质量、鉴定、运输、半衰期和长期安全性等。

1.3 BMSCs-EVs的作用

1.3.1 促进成骨分化、骨重建、骨矿化BMSCs和破骨细胞在内的多种细胞分泌的EVs以及向成骨细胞运输microRNAs可调节骨形成，BMSCs衍生的EVs可以修复、改善BMSCs功能，其中外泌体和微泡是最常用的EVs类别，它们通过将包括核酸、蛋白质和脂质在内的生物活性分子转移到靶细胞中，进一步调节其细胞旁分泌作用，由于MSCs对骨再生的促进作用，MSCs的EVs亦具有促进骨形成的作用［21］。另BMSCs-EVs已被证明可携带成骨相关的基因，从而调节BMSCs的成骨分化和矿化功能，BMSC-EV-miRNAs（miR-29b-3p、miR-20a）通过靶向调节促进BMSCs的成骨分化，BMSCs-EVs可能通过多个关键的miRNA调节BMP/Smad信号传导来影响成骨分化。从蛋白组学方面分析，BMSCs-EVs可上调影响Wnt1和β-catenin的蛋白表达，从而促进BMSCs的成骨分化［6］。

1.3.2 促进新生血管生成EVs在体外和体内均具有增强促血管生成的作用，进而诱导成骨，针对EVs的促血管生成作用的机制以及调节EV在供体细胞中的机制及其不清，然而MSCs分泌的EVs在体外对HUVECs具有强烈的促血管生成作用［22］，BMSCs衍生的EVs通过加速促进血管生成作用，从而促进骨再生。

2 BMSCs-EVs通过PI3K/Akt信号通路调节骨形成的机制

PI3K/Akt信号通路传导关键核心是丝氨酸/苏氨酸激酶Akt，是运输细胞表面受体生长和存活信号的通道，PI3Ks是PI3K/Akt信号通路上游的关键元件。Akt活化中的膜易位由PH结构域介导，催化结构域的结构包括一个ATP结合位点和一个苏氨酸残基Thr308位点，这是Akt活化所必需的磷酸化位点。C端调控区域由40个氨基酸组成，包含一个疏水区，其中包含激活Akt的第二个磷酸化位点，即丝氨酸残基Ser473。主要参与细胞增殖、存活、血管生成和肿瘤细胞侵袭的作用［23］。因此，PKB/Akt信号通路是调节细胞生长、增殖、代谢和存活的核心信号通路之一，PI3K/Akt信号通路通过激活参与细胞周期转换和细胞增殖的下游效应器在许多生理过程中发挥重要作用。在细胞受到不同外界刺激，如生长因子、细胞因子和激素可以诱导PI3K的活性［24］，另外，G蛋白偶联受体也可激活PI3K。PI3K及其下游靶标蛋白激酶B或Akt在细胞存活、增殖、分化、迁移和代谢中发挥关键作用。

2.1 PI3K/Akt信号通路调控骨形成许多骨骼肌肉系统中调节骨再生、骨重建、骨代谢过程的关键信号通路之一是PI3K/Akt通路，该通路被证明与成骨细胞的生长、增殖和分化有关。其中PI3K是一种异二聚酶，是骨吸收和骨形成的关键因素；一旦PI3K被磷酸化，就会激活Akt，PI3K/Akt亦参与成骨细胞生长分化功能和骨骼发育，如Akt1的全身丢失会导致骨量减少，这可能与加速细胞凋亡和成骨细胞分化功能减退有关［25］，PI3K/Akt信号传导涉及多种细胞类型的生长、增殖、分化过程。研究发现，PI3K/Akt信号通路在成骨细胞分化和骨组织代谢中起重要作用，当激活PI3K/Akt信号通路可引起骨组织相关信号分子的一系列变化，如促进成骨分化标志物碱性磷酸酶（ALP）的表达［26］。

2.2 PI3K/Akt信号通路调控BMSC分泌的EVs促进成骨分化PI3K/Akt作为骨骼肌肉系统疾病重要的骨代谢调节剂，能从根本上诱导骨形成。miRNA在MSC衍生的EV中对B淋巴细胞的免疫调节特性的功能，运用这些特异性miRNA可以调节激活PI3K-Akt信号通路，其也是MSC衍生的EV携带miRNA治疗后常见受损的信号通路之一［27］。从BMSCs-EVs的RNA测序层面上分析，可见相关成骨基因表达上调，这可能与激活PI3K/Akt信号通路相关，与microRNA分析结果达成一致。上述研究表明，miR-21、miR-29、miR-221和let-7a在MSC-EVs与BMP和PI3K/Akt信号通路相关，RNA生物信息测序证明了PI3K/Akt信号通路可能是骨重塑调控分子靶点，仅限于发生在骨骼和肌肉系统疾病中［28］。由此可知，PI3K/Akt信号通路与BMSCs-EVs的相关性，在OP治疗中发挥重要作用。

综上所述，BMSCs-EVs通过PI3K/Akt信号通路促进成骨分化，BMSCs-EVs目前仍处于早期研究阶段，尤其在骨科方向研究相对较少，其在骨代谢疾病OP的作用与机制的研究仍较少，且与PI3K/Akt信号通路通过促进成骨影响发病机制的研究较少。BMSCs-EVs的治疗研究仅局限于基础研究实验上，虽已证明其能促进骨再生，但如何将其有效地应用于临床中OP患者的治疗仍面临许多困扰，需进一步开展更多临床试验。研究虽证实在促进成骨分化过程中，BMSCs-EVs与PI3K/Akt信号通路间存在相互联系，但目前具体机制仍不明确。