肌细胞增强因子2C与骨质疏松动物模型研究进展

彭启华，赵玉驰，王力刚

1.南华大学附属邵阳医院，湖南邵阳 422000；2.南方科技大学盐田医院骨科，广东深圳 518000

骨质疏松症（osteoprosis，OP）是一种以骨量降低和骨组织微结构破坏为特征，导致骨脆性增加、易骨折的代谢性骨病。按病因分为原发性和继发性两类，其中原发性常见的有绝经后OP和老年性OP。骨质疏松是由饮食、体力活动、骨基质细胞因子和临床状态（如糖尿病、风湿免疫科性疾病和糖皮质激素应用）等引起的成骨细胞和破骨细胞代谢失衡，是目前与年龄有关的主要疾病之一［1］。目前，我国60岁以上人口已超过2.1亿，约占总人口的15.5%，65岁以上人口近1.4亿，约占总人口的10.1%，是世界上老年人口绝对数最大的国家［2］。随着人口老龄化日趋严重，OP已成为我国面临的重要公共健康问题。骨质疏松骨折的医疗和护理，需要投入大量的人力、物力和财力，造成了沉重的家庭和社会负担。而OP的病因众多，发病机制复杂，成为目前防治的难点。笔者就近年来国内外根据不同病因建立合适的OP动物模型作一综述，骨质疏松动物模型模拟OP的临床症状及病理生理学变化，对深入研究OP的发病机制、新药研发、治疗方案的制定具有重要意义。

1 骨质疏松模型的动物选择

用于骨质疏松模型研究的动物主要有狗、兔、羊、大鼠、小鼠及非人类灵长类动物等。在实验研究中均有各自的优缺点，因此根据研究者的目的，选择适合的动物研究模型。陈旭［3］报道动物模型的选择必须满足以下条件：（1）实验方便操作。（2）可重复性。（3）适宜性。作为模型的适当性和适合生物体的遗传一致性。（4）相关性。研究与人体的变化规律在某方面相关联。（5）符合伦理要求及社会影响。

1.1 狗

成年狗在很多方面与人有相似之处，有很多独特的优点：（1）易于饲养。（2）骨骼较大，便于内、外固定装置和取骨小梁密度检测。（3）狗是杂食动物，与人有相似的消化系统。（4）在骨代谢和骨结构、皮质骨与松质骨比例与人类相似，哈佛重建系统与人类接近，其重建速度比人类快25%，松质骨转换率是人类的2～3倍［4］。（5）去睾丸的狗会导致骨代谢失衡。Fukuda等［5］研究发现将狗睾丸去除后，骨体积伴随性激素下降而丢失，表明去睾丸的狗可作为研究因性腺功能减退和男性性功能下降造成OP的动物。（6）狗用于研究废用性骨质疏松模型较为成功。缺点：狗的骨骼代谢对雌激素的依赖性较低，去势后引起骨丢失不明显。因此，不适合用于绝经后骨质疏松动物模型研究。

1.2 兔

兔是目前应用动物模型研究最多的动物之一，性情温驯，易于饲养，成本低，兔耳的静脉网发达，易取血检测。兔和人的骨骺相似，它们在6～8个月内实现骨骺的完全闭合，且具有类似于人类活跃的哈佛重塑系统，骨转换比其他智齿动物和灵长类动物更快，骨丢失更加显著［6］。

1.3 羊

羊除了有温驯、方便饲养优点外，成年羊具有自动排卵的生理特征，这与成年女性排卵周期相似。但缺点是没有自然绝经期。而且，羊是反刍动物，不适合口服给药研究。去卵巢的雌性羊是研究绝经后骨质疏松动物模型一种不错的选择。Tyler等［7］对比去卵巢（OVX）后，绵羊的脊柱和股骨远端骨小梁微结构的改变，发现脊柱是研究OVX绵羊模型骨骼的首选解剖部位，并证实从去势第一年以后骨结构变化趋于稳定，类似女性绝经后早期快速骨丢失之后的变化规律。Newton等［8］也证实OVX绵羊是雌激素缺乏引起骨小梁结构改变的有效模型，尤其是对绝经早期的妇女的研究。

1.4 大鼠

大鼠被认为是研究与繁殖功能丧失相关的骨骼变化首选动物模型。具有价格便宜、易于饲养、操作方便等优点，且大鼠寿命约3年左右，易于研究衰老对骨骼代谢的影响。目前常用的大鼠品种有Sprague-Dawley（SD）、Wistar、Brown Norway（BN）、Wistar京都大鼠等，FDA指南没有具体说明哪种品系的大鼠最适合OP的研究，但SD和Wistar大鼠是最常用的品系。大鼠6月龄以后，股骨骨密度（BMD）变化较小，12月龄后基本达到平台水平，但选用6月龄大鼠作为研究模型较为常用。通过研究大鼠不同年龄、去势时间对骨骼的影响中，证实6月龄大鼠骨质疏松反应最好。大鼠同样具有与人类相似的生殖周期。研究证实大鼠骨骼会受到性腺类固醇定期波动的影响，尤其是卵巢分泌激素的丧失更为敏感。因此，大鼠是目前研究绝经后骨质疏松最受欢迎的动物模型。但也有缺点：（1）去势后的骨代谢变化在短期内与绝经后的变化相似，但从长期变化来看它们是不同的。（2）与皮质骨相比，OVX大鼠松质骨的干预后变化更好、更快，研究去势后大鼠皮质骨变化可能需要更长时间。（3）OVX成年大鼠存在骨骼纵向生长可能。（4）大鼠不存在自然脆性骨折。

1.5 小鼠

小鼠是医学研究常用的动物之一，同样具备和大鼠相似的优点，尽管目前作为研究骨质疏松动物模型频率并不多，但在未来的研究对雌激素缺乏导致OP的发病机制及诊治的动物模型比大鼠可用性更有优势。随着近年来对遗传基因分子在骨生理学领域的研究和应用，通过导入或敲除目的基因对小鼠进行骨代谢遗传因素的研究，观察其表型特征和病理变化成为OP研究领域的热门。

1.6 非人类灵长类动物

以上动物模型在实际上存在一些不足之处，近年来有对大型动物模型研究骨质疏松的趋势。非人类灵长类动物模型是目前评价新药实体治疗和预防雌激素缺乏骨丢失和OP药物的安全性和有效率性最广泛的大型动物模型。其中猕猴和狒狒常用之一。优点包括：（1）根据FDA指南，除啮齿动物外，灵长类动物是用于OP治疗的主要大动物模型。（2）在遗传规律和直立行走姿势上与人类有许多相似。（3）在骨生物力学特征和组织器官有许多同源性，尤其是在骨小梁和皮质骨重塑过程、月经周期和生殖激素模式与人类相似。在老年雌性猴子（食蟹猴和恒河猴）中，OVX会导致骨高转换和快速骨丢失状态，OVX后停止周期性分泌生殖类激素导致的长期后遗症类似于妇女发生的雌激素耗尽和绝经后骨丢失［9］。灵长类非人类动物模型缺点：饲养和驯养条件严格，饲养比较困难，价格昂贵，且灵长类动物和人一样，可携带各种传染性疾病［10］。

2 骨质疏松模型

2.1 内分泌的缺失

研究证明绝经后骨质疏松的发生与雌激素水平下降明显相关，由此可用手术直接切除动物双侧卵巢使雌激素水平降低，诱发与女性绝经后相似的骨量丢失和骨结构改变，建立骨质疏松的实验模型。有报道观察早期接受双侧OVX的雌性动物会过早经历绝经后症状和副作用，类似于人类更年期状态，因此动物OVX可以作为研究绝经后骨质疏松模型［11］。但并不是所有动物都适合研究绝经后骨质疏松，需要考虑众多因素，如动物模型有类似于人类月经周期变化的繁殖周期，且在这样的模型中，在全年周期变化中骨骼会受到性激素波动的影响。而季节性繁殖的动物中，每年经历一次或两次的繁殖周期，通常是不能反映OVX后骨骼变化。大鼠OVX术以背侧、腹侧皮肤切口两种方式为主。李明等［12］应用两种大鼠OVX术式对比，通过观察两种手术用时、出血量、术后出现感染等并发症、及测量BMD等情况，发现背侧部双切口操作更为简单，手术用时少，术后并发症少，安全性更高。Fujita等［13］通过OVX和睾丸切除（ORX）对雌性老鼠和雄性老鼠下颌骨髁突形态影响对比研究表明，这两种方法能有效减少骨小梁体积。并发现雌性老鼠的变化比雄性小鼠更显著。大鼠OVX的成功主要通过对比大鼠体重、子宫的重量变化，动情周期、激素谱［包括雌二醇、黄体生成素（LH）、卵泡刺激素（FSH）、孕酮的周期变化）］来证实［14］。甲状旁腺切除诱导甲状旁腺素分泌缺失，导致1，25-（OH）2D3合成减少，肠道钙、磷吸收减少，诱发OP。脑源性骨质疏松，如通过破坏下丘脑-垂体轴或弓状核导致神经内分泌细胞功能减退、缺失，成功建立诱导大鼠骨质疏松动物模型［15］。

2.2 类固醇类激素诱导

随着糖皮质激素（Glucocorticoid，GC）在临床的广泛应用和相关并发症的研究，发现GC诱导OP发病率仅次于绝经后骨质疏松和老年性骨质疏松。GC主要对骨细胞、成骨细胞和破骨细胞的直接损伤，尤其是抑制成骨细胞的增值和分化，促进成骨细胞和骨细胞的凋亡，延长破骨细胞的生存时间，同时减少血管内皮生长因子释放、抑制骨骼内血流。抑制肠钙吸收，促进尿钙的排除，导致负钙平衡，从而促进骨吸收，骨量减少、骨强度降低，骨折风险增加［16］。研究表明［17］，由于OVX或GC单独干预诱发骨质疏松有耗时、不一致等局限性，以及与OVX相比，虽然GC可能诱导更多进行性骨丢失，但在GC停止后，骨丢失会发生逆转。因此，越来越多倾向于两者联合干预，可迅速诱导明显的骨丢失，且没有像单独应用GC干预停止后，导致骨丢失反弹［17］。Diana等［18］通过OVX和GC联合应用证明可在短时间内建立绵羊骨质疏松模型。

2.3 炎症诱导导致骨质疏松

研究表明，类风湿性关节炎（RA）是慢性炎症导致的OP。表现为局部骨质减少，尤其是关节附近的骨质［19］。研究表明关节附近骨质丢失是炎症细胞因子如白细胞介素（IL-6，一种有效的破骨细胞活性刺激物）或肿瘤坏死因子（TNF）持续影响的结果，以抗环瓜氨酸蛋白自身抗体的RA患者中常见。Hoshino等［20］利用胶原诱导关节炎（CIA）大鼠研究早期RA和幼年RA患者炎症关节附近骨质疏松的机制，结果表明炎症关节附近的骨质疏松是由于CIA大鼠的免疫反应引起的骨形成和骨吸收之间失衡，并发现骨形成的减少能在一定程度上先于关节炎的临床发作。Enokida等［21］探讨关节炎对2月龄和7月龄CIA大鼠胫骨BMD的影响，结果表明成年CIA大鼠的骨丢失类似于人类RA早期发生的OP，并阐明成年CIA大鼠较幼年CIA大鼠更适合作为RA继发性骨质疏松的实验模型。关节炎诱导骨质疏松动物模型在狗的模型中已经开展，通过关节内注射卡拉胶诱发关节炎，导致关节炎肢体的骨质疏松［22］。将来有望通过关节腔内注射刺激性物质诱导关节炎的骨质疏松模型，为研究人类关节炎相关并发症提供更有价值信息。

2.4 废用性骨质疏松模型

骨的负荷力是影响骨代谢的关键因素之一。与影响全身骨骼结构改变的OVX或类固醇激素诱导OP相比，废用性OP是由于骨骼的机械负荷减少而诱发的骨丢失，降低局部骨骼的机械应力会抑制成骨细胞介导的骨形成，加速破骨细胞介导的骨吸收，从而诱发废用性OP。Watanabe等［23］对人类长期卧床90天的研究中发现，骨丢失是由于骨吸收显著增加并伴有骨形成受到轻微抑制导致。Zerath等［24］比较悬浮大鼠与正常负载大鼠发现，无论食物类型如何，悬浮大鼠的骨骼纵向生长率、松质骨体积和骨形成率较低，并证实骨骼低负荷导致骨形成障碍和骨细胞内生长因子代谢异常与局部改变有关。其他有尾部悬吊、后肢固定、坐骨神经切除、肌腱切除和石膏管型固定等方法诱发废用性骨质疏松动物模型。临床中以长期卧床、石膏托外固定、及中枢或外周神经损伤导致运动性截瘫等是常见的原因。随着人口老年化及创伤因素的增多，导致废用性骨质疏松的患病率逐年增加。

2.5 基因敲除诱发骨质疏松动物模型的建立

近年来，随着医学的发展和对OP的深层次的研究发现，OP是一种多基因导致的疾病，参与骨代谢因子的缺乏和过表达会导致骨骼的变化。

骨桥蛋白（Osteopontin，OPN）是骨基质中含量较丰富的非胶原蛋白之一，由成骨细胞和破骨细胞产生。Yoshitake等［25］报道通过外周定量CT分析显示，野生型小鼠哈佛后骨体积减少约60%，而OPN缺陷小鼠哈佛后骨体积仅减少约10%，证实与野生型小鼠相比，OPN基因敲除小鼠对卵巢切除诱导的骨吸收具有抵抗力。护骨素（Osteoprotegerin，OPG）又称破骨细胞生成抑制因子（OCIF）或TNF受体样分子（TR1），是TNF受体家族的一员，通过抑制破骨细胞的分化和活化来调节骨量，在小鼠中过表达OPG导致严重的骨化症，而OPG缺陷小鼠表现出骨吸收增加、破骨细胞数量和活性增加、BMD减低以及骨折的高风险，最终导致全面骨质疏松［26］。研究发现OPG［27］与OPN不但与骨质疏松有关，还与血管钙化性心血管疾病存在相关性。文献报道c-Abl蛋白（是一种非受体酪氨酸激酶）缺陷的小鼠会发生，证实c-AbI对成骨细胞的分化和骨形成有积极调节作用，而缺乏c-AbI的小鼠表现为OP。Biglycan（BGN）是存在于骨骼和其他非骨骼结缔组织中一种细胞外基质成分。Xu等［28］研究表明BGN敲除小鼠表现为生长速度减慢和骨量减少，并随着年龄的增长变得更加明显。并发现骨的强度和弹性由另外一种细胞外基质有序矿化（ECM，由I型胶原和一系列非胶原蛋白组成），ECM缺乏小鼠会导致骨重建减少，骨量严重丢失，并随着年龄的增长变得更加明显。因此，这些小鼠可作为研究骨细胞外基质蛋白在骨质疏松中作用的动物模型。

硬化蛋白（Sclerostin，SOST）是一种由SOST基因（人类SOST基因位于17q12-21，长约200 kb，含有两个外显子和一个内含子，编码由骨细胞分泌抑制成骨的SOST）编码分泌型蛋白。SOST是骨形成的负性调节因子，与脂蛋白受体相关蛋白（LRP4、LRP5、LRP6）受体结合。作为经典Wnt信号的细胞外抑制因子，作用于遗传性疾病，如硬化症或Van Buchem（VB）病，导致SOST终生缺失或减少的患者。Ominsky等建立抗骨SOST单克隆抗体（ScI-Ab）哈佛大鼠和幼年食蟹猴骨质疏松动物模型，结果显示ScI-Ab对SOST的抑制增加骨形成，减少骨吸收，从而改善骨结构、骨量和骨强度。目前，对于骨SOST单克隆抗体研究已经进入临床试验，有望成为治疗OP的新靶点。

近年来，骨形态发生蛋白（bone morphogenetic protein，BMP，是一种分泌型信号分子）引起越来越多学者的关注，尤其是BMP-2的研究。研究证明，BMP-2是存在骨基质内骨诱导生长因子BMPs家族成员之一，BMP-2受体具有丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶结构，其信号传导机制与转化生长因子（transforming growth fator，TGF-）受体类似，功能主要是在骨折愈合中促进成骨细胞分化及其他成骨因子的表达，进而导致骨骼的形成［29］。刘铭等［30］对大鼠股骨上端行局部注射BMP-2，行BMD检查后，证实局部注射BMP-2可快速、有效的提高局部的BMD及骨生物力学强度，增强局部抗骨折能力，这将为老年髋部骨折提供一种新颖防治措施。

Sclerostin与BMP的关系：Johanna等［31］研究发现小鼠和人体内识别一种cDNA，可编码一种新型的BMP抑制剂，和Sclerostin最为同源（其中氨基酸序列同源37%）。WinkIer等［32］报道硬化症是一种由于SOST表达缺失而导致骨量增加的疾病，SOST基因蛋白产物Sclerostin与BMP受体竞争结合，可减少BMP信号传导，抑制骨细胞矿化，过表达SOST的转基因小鼠表现为低骨量和骨脆性减弱，证明骨细胞释放的Sclerostin通过下调BMP活性来调控成骨细胞的增值、分化和成熟成骨细胞的活性。随着对BMP-2的研究深入，发现很多药物可以上调BMP-2的作用，如他汀类药物、雌激素等，为将来研究以BMP-2为靶点治疗OP提供方向。

2.6 维A酸大鼠骨质疏松动物模型

破骨细胞中维生素A信号传导是通过维A酸受体来调节。Shingo等［33］从兔中提取破骨细胞，发现组织蛋白酶K/OC-2在成熟破骨细胞中高表达，并证实全反式维A酸可在转录水平上调节成熟破骨细胞组织蛋白酶K/OC-2的基因表达，即维A酸可通过破骨细胞调节部分骨形成和代谢。目前，已有通过口服维A酸成功建立大鼠骨质疏松模型［34］，来研究维A酸导致骨质疏松的发生机制及防治药物。

3 MEF2C与骨质疏松的关系

肌细胞增强因子（Myocyte enhancer factor-2，MEF2，是与多种肌肉特异基因控制区的富含A/T的DNA序列结合）最先描述是在骨骼肌细胞中高表达的转录因子，后来发现在神经元及心肌细胞中也有高表达［35］。哺乳动物的MEF2家族转录因子由MEF2A、MEF2B、MEF2C、MEF2D组成。MEF2C与MEF2D被证明是软骨内骨形成过程中软骨细胞肥大必须存在的因素［36］。在股骨皮质骨中以骨细胞为主的定量基因表达分析表明，MEF2C的表达最强。

目前，对骨质疏松的病因、发生机制深入研究，发现Wnt/-catenin信号通路在骨重塑中起关键作用［37］，而SOST基因编码Sclerostin蛋白与LRP5/6受体结合拮抗Wnt/-catenin信号传导通路，即Sclerostin是Wnt信号的拮抗剂，进而影响骨细胞及成骨细胞功能［38］。文献报道组蛋白脱乙酰基酶5（HDAC5）在体内外对骨SOST水平的负性调节，利用shRNA慢病毒感染Ocy454细胞行HDAC5基因敲除小鼠，表现出SOST表达水平升高，SOST阳性骨细胞增多，Wnt信号活性降低，骨小梁密度降低，成骨细胞形成减少。人类缺乏Sclerostin会导致骨硬化症和VB病，进一步研究发现是由Wnt信号通路过度激活引起全身骨骼增生症［39］。报道发现SOST基因的远端增强子进化保守区5（Evolutionarily conserved region 5，ECR5），而MEF2是ECR5区域中转录因子的结合位点，在骨代谢中调节SOST的表达。在VB病缺失区发现一个增强子ECR5，并在体外证明ECR5的转录活性受MEF2C转录因子调控，并证实缺乏ECR5或MEF2C的小鼠由于骨形成率升高而导致高骨量［40］。Nicole等也证实缺乏SOST特异性调控元件ECR5会使啮齿类动物发生VB病，而在成年骨骼中MEF2C是依赖于ECR5的SOST转录激活的重要转录因子［39］。Olivier等通过实验证明，甲状旁腺激素（PTH）可以抑制SOST的表达，而SOST在成人骨细胞中的表达和PTH对其的抑制作用是由控制SOST骨增强剂的MEF2A、C、D转录因子介导［40］。有研究进一步证实MEF2C是骨细胞中SOST表达所必须的因素，并通过Dmp1-Cre诱导MEF2C缺失，导致3.5个月龄和5～6个月龄小鼠股骨皮质骨中SOST表达减少40%和70%，并发现MEF2C突变雄性大鼠皮质抗破骨细胞因子和Wnt/-catnein信号的靶基因OPG的表达也增加了70%，证实MEF2C也可以通过调节破骨细胞骨吸收来调控骨量。

目前，尽管SOST基因与MEF2C之间关系并未明确，但通过MEF2C-SOST-Wnt信号轴来揭示骨形成的机制，探讨MEF2C影响SOST基因表达来调控骨代谢，是MEF2C治疗骨质疏松的关键。

4 展望

近年来，对骨质疏松的预防和治疗由于长期治疗的风险/收益比低而受到质疑，迫切需要安全有效的替代疗法来治疗OP。因此，通过模拟人类骨代谢相关的变化建立绝经后内分泌减少、激素诱导以及废用性、基因敲除等诱导骨质疏松动物模型，对骨质疏松的病因及发生机制深层次的研究探讨。本课题下一步将从MEF2C调控骨代谢的作用机制着手，为将来研究骨质疏松的病因、发生机制提供实验依据，为防治措施提供理论基础，为治疗骨质疏松提供新策略。