MicroRNA早期诊断子宫内膜异位症的研究进展*

陈渝，夏晓梦

（中南大学湘雅二医院，湖南长沙410011）

子宫内膜异位症（endometriosis， EMT）是一种以子宫腔外存在子宫内膜（覆盖子宫腔的黏膜）样组织为特征的疾病[1]。其能够引起慢性炎症反应，导致盆腔内或其他部位形成瘢痕样组织[2]。最新研究统计，EMT 影响着全球大约10%的育龄女性[3]。该病为慢性疾病，常伴有严重的痛经、性交痛、排便痛、排尿痛和慢性盆腔疼痛等临床症状，严重降低了患者生活质量[4]。EMT 的症状多样、发病部位广泛，很多患者对病情的认知也十分有限，往往在临床症状出现较长时间后才做出诊断。目前，EMT 尚无有效的治愈方法，治疗手段通常旨在去除病灶，控制症状[5]。因此，EMT 的早期诊断对疾病的后续治疗非常关键。

诊断EMT 的金标准为探查性腹腔镜，这是一种侵入性检查方法[6]。因此，找到非侵入性或无创的诊断方法，实现EMT 的早期诊断非常必要。学者们逐渐认识到非编码RNA 分子在人类健康和疾病病理生理过程中发挥关键作用。在这些非编码RNA 中，MicroRNA（miRNA）是真核生物中广泛存在的一种由21～23 个核苷酸组成的RNA 分子，可调节其他基因表达[7]。miRNA 从DNA 转录而来，但无法进一步翻译成蛋白质。miRNA 通过与目标mRNA 结合，进而抑制转录后的基因表达，在调控基因表达和细胞周期方面起着重要作用。miRNA被认为是一种广泛的转录后调节分子[8]。每个单独的miRNA 分子都可能影响细胞途径中的多种mRNA靶点，目前已经有超过2 600 个成熟的miRNA 被研究[9]。大多数细胞和体液中都发现了miRNA，其具有意想不到的高稳定性。健康人群与患者循环中的miRNA 表达谱有明显差异。在各种疾病如肿瘤、炎症、心血管疾病、代谢和生殖系统疾病中，都观察到特定的miRNA 表达水平差异[10]。目前，miRNA 被提议作为临床诊断工具，用于识别和监测各种恶性肿瘤，并有可能为其他疾病提供无创诊断。在女性生殖系统疾病中，如妇科恶性肿瘤（如宫颈癌、卵巢癌和子宫内膜癌）、妊娠期相关疾病（如先兆子痫、早产等）、子宫肌瘤及EMT，都已经发现了miRNA 表达失调[11-13]。

1 早期诊断EMT的困境

根据病变部位的不同，EMT 主要分为4 种病理类型：浅表型、卵巢型、深部浸润型及其他部位EMT，其临床症状多种多样，且随着病灶对盆腔、卵巢、输卵管或子宫的作用还会导致不孕。此外，子宫内膜异位病变的程度与症状的严重性或持续时间几乎没有相关性。一些病灶明显的患者，症状反而较轻；而病灶很小的患者，却可能出现严重症状[14]。通常EMT 引起的疼痛会在绝经后得到改善，但在某些情况下，慢性疼痛在绝经后仍长时间持续存在。对患者和医生来说，EMT 最大的挑战之一是早期诊断。据报道，EMT 确诊时间一般延迟6～12年[15]，这种延迟是由社会和临床因素造成的。例如，患者即使出现EMT 的症状，考虑到隐私问题，往往推迟就医。目前25%～50%不孕症由EMT 引起[16]，一些女性尽管已经有多年的慢性盆腔疼痛和不适，但是只有在妊娠失败时，才首次确诊为EMT。因为EMT 的症状可能是非特异性，可以与其他盆腔疾病重叠，对临床医生鉴别诊断经验要求更高。值得注意的是，由于临床专业知识，以及适合筛查、简便的无创性诊断方法缺乏，在贫困及医疗条件较差的地区，EMT 的诊断时间往往会更长。

在腹腔镜检查明确诊断前，临床医生会根据患者症状进行经验性治疗。EMT 的一线药物包括非甾体抗炎药，口服避孕药、地诺孕素、促性腺激素释放激素激动剂（gonadotropin releasing hormone agonist， GnRH-a）[17]。然而，这些药物都不能根除EMT，服药期间还会产生一定的副作用。当治疗停止后，EMT 相关症状还会重现，即使进行手术，EMT 复发也很常见，50%患者在5年后需要再次手术[18]。

2 miRNA在EMT中的生物学作用

miRNA 可以通过抑制翻译或刺激mRNA 降解来下调基因表达。在某些情况下，miRNA 还可以上调靶基因的表达。miRNA 影响从发育到致癌的多种细胞途径。miRNA 参与多种人类疾病，使其成为潜在的诊断和预后生物标志物。与肿瘤转移类似，异位子宫内膜具有黏附、增殖及浸润细胞外基质的能力。EMT 是一种多因素和多基因疾病，其病理机制涉及血管生成和蛋白水解，miRNA 表达失调可能与这些过程有关。在子宫内膜基质细胞（endometrial stromal cell， ESC）和上皮细胞中，LOGAN 等[19]发现与正常样本比较，异位ESC 和上皮细胞有9 个和16 个差异表达的miRNA。有研究发现，与EMT 有关的mRNA 靶点是血管内皮生长因子A（vascular endothelial growth factor A， VEGFA），其受5 种miRNA 的调节。这些信号蛋白能够刺激血管生成，并参与EMT 病灶的血管生成[20]。不同部位病灶中VEGF-A 表达水平有区别，腹膜和直肠阴道结节中表达水平比卵巢高，表明前者血管生成更为活跃。VEGF 受体拮抗剂和其他抗血管生成药物是治疗EMT 的药物[21]。动物模型证明，抗血管生成药物可抑制异位内膜的生长，减少或缩小异位病灶的数量和体积。基质金属蛋白酶（matrix metalloproteinases， MMPs）也被证实为EMT 相关的miRNA 靶点，而且组织金属蛋白酶抑制剂也受miRNA 的调节[22]。这些蛋白水解酶降解细胞外基质，有助于组织重塑和异位内膜侵入腹膜。对分离培养的ESC 进行mRNA 的表达分析，发现在EMT 患者中有几个相同的mRNA 靶点被改变，即ZEB1、MMP-7 和TGF-β1[19]，后者参与了EMT 上皮间质转化（epithelial-mesenchymal transition， EMT）过程。总之，细胞增殖、血管生成、细胞外基质重塑、炎症信号传导及激素调节等过程在EMT 失调的miRNA 功能研究中均有涉及。

3 子宫内膜组织中的miRNA表达差异

miRNA 的全局分析方法可以用来比较组织间所有miRNA 的表达。EMT 中最常见的是比较同一患者的在位内膜与异位内膜miRNA 的表达差异，但也有研究将异位内膜与健康人群子宫内膜进行对照分析。通常通过实时荧光定量聚合酶链反应（quantitative real-time polymerase chain reaction， qRTPCR）等技术确认候选miRNA 的表达差异，不过即使miRNA 表达差异微小也可能产生不同的生物学的效应。WEI 等[23]对2007年—2013年发表的12 项miRNA 表达谱研究进行了荟萃分析，发现了134 个不同调控功能的miRNA。虽然个例通常只说明实验中的一组上调或下调的miRNA，但在多个研究中发现的miRNA 分子的数量正在增加，并逐步形成miRNA 调控网络。miRNA 在EMT 中的表达研究结果发现，卵巢异位内膜和在位内膜活检样本中miR-200b 的关注度最高[24]。其他有关miR-200 家族的研究也表明，miR-200 在EMT 发病机制中起着关键调控作用[25]。还有一些研究报道miRNA 在子宫内膜病灶中上调或下调，如miR-1、miR-29c、miR-34c、 miR-100、 miR-141、 miR-145、 miR-183、 miR-196b、 miR-200a、 miR-200b、 miR-200c、 miR-202、 miR-365 和miR-375[26]。 ZHAO等[27]通过高通量测序技术在8 例EMT 患者中确定了异位子宫内膜与在位子宫内膜中miRNA 的差异，鉴定出107 个差异表达的miRNA 和6 112 个差异表达的mRNA，并确定了一些参与EMT 发病的关键miRNA。RAJA 等[28]总结发现，EMT 病灶中一系列功能失调的miRNA-126、miRNA-210、miRNA-21、miRNA-199a-5p 和miRNA-20A 参与了血管生成、细胞增殖、细胞黏附和侵袭，以及EMT 过程。

为了探究miRNA 调控细胞的机制，研究者使用生物信息学工具识别每个miRNA 序列的靶标，并将这些目标基因的功能映射到细胞途径中[23，29]。WEI 等[23]使用4 种miRNA 靶点预测工具（TargetScan、PicTar、miRanda 和miRDB），对几项研究中一致发现的miRNA 进行预测，然后通过GeneCodis 网络工具预测这些基因参与的生物过程和途径。该研究分析出9 882 个有关的miRNA 靶基因，通过KEGG和Panther 路径富集分析，得出了主要的EMT 相关路径、内吞作用、Wnt 信号通路和血管生成靶基因[23]。QI 等[29]用Ingenuity Pathway Analysis 和Gene Ontology 等生物信息学软件分析了EMT 中差异表达的miRNA，共鉴定了17 个显著差异表达的miRNA和4 343 个参与EMT 的潜在miRNA。这些生物信息学分析为细胞培养的功能研究的实验设计提供信息，并能帮助EMT 患者确定新的治疗方法。

4 循环miRNA谱系研究

细胞外miRNA 可以从大多数体液中分离出来。miRNA 参与体内细胞与组织的压力信号传递和交流。细胞外miRNA 要么被动释放，要么通过外泌体或微囊泡主动从细胞中分泌出来，并与脂蛋白或RNA 结合蛋白结合。这些脂质和蛋白质复合物可以保护miRNA 不被内源性RNAs 降解[30]。循环miRNA 可能介导异位内膜的基因表达改变，也可能通过介导异位内膜与周围组织的交流来影响EMT 的发展。最新研究显示，循环miRNA，如Let-7 家族的miRNA，与EMT 的炎症信号改变之间存在关联[31-32]。为进一步探索EMT 中循环miRNA 潜在的作用，迄今已报道6 项有关EMT 患者与不同对照组的血液样本全局基因表达谱分析结果；其中3 项研究采用血清miRNA 微阵列，2 项研究采用血浆miRNA 微阵列，另外1 项采用深度测序方法检测血清miRNA 的差异表达[33]。除了分析来自不同血清与血浆的miRNA，miRNA 表达检测在实验设计上有巨大差异，使这些研究结果的比较变得复杂。这些差异包括miRNA 分析方法、受试者遗传背景、EMT 所处的临床阶段、EMT 病理类型，以及对照组的设置。由于miRNA 在细胞中有许多靶点，而一个特定的mRNA 转录会受到各种miRNA 的调控，同一途径可能受到不同的miRNA 的调控，所以没有检测到一个特定的分子并不排除其参与EMT 的进展。Solexa测序技术研究报告失调miRNA有108个候选miRNA，不过这些结果与其他报告的血清结果有大量重叠[34]。也有研究对EMT 患者腹腔液中的miRNA、细胞因子及其他蛋白质进行分析，确定了126 个不同表达的miRNA，其中6 个通过qRTPCR 验证。跨独立数据集的表达水平变化的交叉验证结果表明，这6 个miRNA 与EMT 关系密切[35]。因此推测，这些在血液和子宫内膜组织中表达改变的miRNA 有可能作为早期诊断EMT 的生物标志物。

5 循环miRNA可作为潜在的早期诊断EMT的生物标志物

研究发现有5 个miRNA 经过多次筛选被确定有异常表达，体外实验也证明了其在EMT 中的作用[33-35]。目前，miR-125b、miR-451 和Let-7 家族被认为最适合作为EMT 潜在的循环生物标志物，而miR-199a 和miR-145 也有作为早期诊断EMT 的生物标志物的潜力。

5.1 miR-125b

在EMT 中，miRNA 的一个主要功能是参与炎症反应。Let-7b 和miR-125b 均能调节炎症细胞因子信号，影响TNF-α、IL-6 和IL-1β 表达水平，这些因子在EMT 患者血液中明显增加。一项前瞻性研究结果显示，IL-1β 升高与EMT 患病风险增加有关；IL-6 在EMT 相关的巨噬细胞中高度表达，影响了EMT 进展时的细胞迁移。伴随着Let-7 与miRNA-125b 在炎症信号传导中的互补作用，这些miRNA 也因其在21 号染色体长臂（21q21.1）上的基因组位置而聚在一起[36]。Let-7、miR-125b 及miR-200 都参与了癌症进展，其中miR-125b 可以调控细胞凋亡和增殖。MOUSTAFA 等[37]使用miRNA 测试板作为检测EMT 的非侵入性诊断方法，发现miR-125b 在EMT 受试者血清中表达水平显著升高。据报道，在GnRH-a（醋酸亮丙瑞林）治疗后，EMT 中miR-125b 转录发生改变，表明其有可能成为监测疗效的生物标志物[38]。

5.2 miR-145

CHENG 等[39]选择47 例EMT 患者，miR-145 的表达水平高于对照，并且在非妊娠患者子宫内膜组织中的表达水平显著高于妊娠患者，其研究表明miR-145 表达上调可能在EMT 不孕症患者中发挥重要作用。YANG 等[40]报道与在位内膜比较，同一患者的异位内膜miR-145-5p 表达水平更高，该过程伴随VEGF-A 上调和EGFR2、PTEN 和CXCR4 水平下降。有研究发现，Ⅰ/Ⅱ期EMT 患者的miR-145水平明显高于Ⅲ/Ⅳ期。陶中娥等[41]通过对122 例EMT 合并不孕患者的研究发现，术前miR-145 表达水平对术后妊娠结局有一定的临床预测价值。BASHTI 等[42]收集了55 例EMT 患者，结果发现miR-145 在Ⅰ/Ⅱ期EMT 患者中过度表达。

5.3 Let-7家族

Let-7 是第一个被发现的人类miRNA。Let-7 家族的miRNA 由8 个相关序列（Let7a-i）组成，已知其参与人类和其他动物的早期发育事件。Let-7 调控细胞分化的许多基本过程，并能抑制细胞的重新编程。由于对Ras 家族致癌基因的负向调控，其被归类为肿瘤抑制因子，许多恶性肿瘤中都出现let-7 miRNA 家族表达下调。最近在EMT 患者中观察到KRAS 的激活，并与EMT 发病和孕酮抵抗有关[31]。黄俊花等[43]分析文献后也发现EMT 患者血清Let-7表达降低可作为临床诊断标志物。从切除的EMT样本中获取总RNA，分析发现EMT 患者与正常对照组的Let-7 表达存在显著差异，表明Let-7 具有最佳的参数（敏感性、特异性、阳性和阴性结果的预测值），可用于EMT 的早期诊断[44]。

5.4 miR-199a

与miR-145 相似，miR-199a 过度表达降低了ESC 的黏附性、迁移性和侵袭性。目前学术界提出了一种机制，即在EMT 组织中下调这种miRNA，通过抑制PAK4、IKK/NF-κB 途径和下调IL-8 来减弱细胞侵袭性。ZHU 等[45]研究发现，miR-199a 在人子宫内膜异位囊肿基质细胞中的表达减弱，进一步使用Transwell 实验、体外伤口愈合试验评估转染miR-199a 对ESC 迁移、侵袭和收缩性的影响，结果表明miR-199a 通过抑制PAK4 mRNA 表达来抑制ESC 的迁移和侵袭，miR-199a 可能在EMT 中发挥肿瘤抑制因子的作用[45]。也有学者发现，在来自卵巢的en-MSCs 中加入合成类固醇激素时，miR-199a表达上调，表明miR-199a 的作用与达那唑药物相似，即破坏雌激素的信号传导并抑制EMT 进程；进一步研究显示，在缺氧条件下，miR-199a 能抑制ESC 中VEGF-A 和缺氧诱导因子1α，并减少血管生成[35]。在另一份报告中也发现，中、重度EMT患者血清miR-199a 表达水平高于轻症患者。袁琳等[46]研究发现EMT 患者血清miR-199a 表达显著升高，提示miR-199a 具有成为诊断EMT 生物标志物的潜力。

5.5 miR-451

WANG 等[47]采用qRT-PCR 检测EMT 和不孕症患者血清、组织和细胞系中miR-451 和巨噬细胞抑制因子（macrophage migration inhibitory factor， MIF）表达水平，结果发现与健康人群相比，EMT 合并不孕症患者组织和细胞系中miR-451 异常低，而MIF异常高；miR-451 表达水平与EMT 患者并发不孕症呈负相关。LI 等[48]通过抑制miR-451 治疗EMT 小鼠，结果发现miR-451a 抑制剂可减少EMT 病变大小，表明miR-451 抑制剂进行全身治疗是一种很有前景的治疗方法。采用小鼠进行研究后发现miR-451 下调是通过抑制Wnt 信号通路来实现的，表明miR-451 在辅助生殖治疗中可作为判断卵母细胞和胚胎质量的新型生物标志物[48]。GAO 等[49]研究发现，EMT 患者miR-451 表达水平低于健康对照组，并且miR-451 可诱导细胞凋亡并抑制细胞增殖。石瑾秋等[50]选取54 例EMT 患者，采用qRT-PCR 检测发现EMT 患者血浆miR-451 水平减低，miR-451 可能通过抑制异位内膜基质细胞增殖和迁移发挥作用。

6 小结与展望

miRNA 成为EMT 循环生物标志物需要符合以下标准：①在体液（血液、唾液等）中表达稳定且具有十分明显的表达差异；②存在于EMT 的不同亚型，并且参与支撑该病所有临床表现的共同过程；③不受一天中取样时间或月经周期阶段性的影响；④在不同种族背景的女性中表现出一致的表达模式。因此，建立这些循环生物标志物的有效性仍旧需要从大量患者群体中获得可重复的结果，并尽可能了解其表达与EMT 进展的关系；同时开展纵向的临床研究，进一步分析哪些miRNA 与EMT病情进展程度最相符，哪些与疗效或复发明确相关。因此，通过对与EMT 病理生理相关的miRNA进行研究，找到合适的生物标志物作为早期诊断、预测疗效的工具，以指导治疗仍是临床医生未来努力的方向。