中药喹诺酮类药物耐药抑制剂筛选

张 静，范葶莉，穆春雨

（沧州职业技术学院畜牧兽医系，河北 沧州 061000）

近年来，由于抗微生物药物的广泛及不合理应用，大量细菌产生了耐药性，这导致药物临床疗效的降低，甚至无效，感染畜禽的发病率和死亡率明显升高。中药是我国的天然资源，具有资源广、毒副作用低等特点，因此，在中药中筛选耐药抑制剂具有广泛的应用价值和良好的开发前景。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 菌株 猪源大肠杆菌耐药菌 A-3，由本研究室分离鉴定并保存；标准大肠杆菌质控菌ATCC 25922，购自中国兽药监察所。

1.1.2 药品 盐酸环丙沙星，含量为 98.1 %，批号 211101；中药材：五倍子、胡椒、细辛、山楂、金银花、牡丹皮等30味中药材。

1.1.3 培养基及试剂 培养基：LB培养基，批号 100311；麦糠凯琼脂培养基，批号 100414；试剂：95 % 乙醇，TTC。

1.1.4 仪器设备 电热恒温鼓风干燥箱：上海一恒科技有限公司；YXQ-LS-50SⅡ型高压蒸汽灭菌锅；ZD-85型气浴恒温振荡器：金坛市金城国胜实验仪器厂；旋转蒸发仪：德国 Heidolph；微量移液器：德国eppendorf公司。

1.2 方法

1.2.1 药品储备液的制备 盐酸环丙沙星储备液：盐酸环丙沙星用灭菌水配成 5 120 µg/ml，经过滤除菌后，保存于 4 ℃ 冰箱备用。中药储备液：30味中药分别用乙醇回流2次，滤液合并、减压浓缩、离心后定容至生药浓度为 1 g/ml，此为醇提液，剩余药渣再水煎 2次，合并 2次煎液，浓缩离心定容至生药浓度为 1 g/ml，此为水煎剂。均过滤除菌后保存于4 ℃ 冰箱备用。

1.2.2 盐酸环丙沙星及中药提取物最低抑菌浓度（MIC）测定 MIC测定具体方法：采用试管 2倍稀释法进行，将培养过夜的大肠杆菌 A-3菌盐酸环丙沙星 MI液用肉汤做 500~1 000倍稀释，校正菌液浊度至 0.5麦氏单位，标准盐酸环丙沙星储备药液做5倍稀释后再将药液倍比稀释9个梯度，浓度依次为 512、256、128、64、32、16、8、4、2 µg/ml，每管依次用微量移液器加入稀释后的菌液 100 µl，每组设阴性对照组、阳性对照组以及空白对照，加液完毕后，充分震荡混匀，于 37 ℃ 培养箱培养 16~18 h。药品作双样品测定，记录无菌生长的最低浓度为盐酸环丙沙星MIC。

中药提取物MIC测定具体操作方法参照盐酸环丙沙星。若因中药提取液颜色太深或是中药与营养肉汤发生反应而出现沉淀现象影响 MIC读取，应采用滴加TTC或平板划线培养再做观察。

1.2.3 中药耐药抑制剂的筛选 选取无抑菌效果的中药提取物，直接等体积加入已经倍比稀释 5个梯度的盐酸环丙沙星中，并设置对照。加液完毕后，充分震荡混匀，于培养箱 37 ℃ 培养 16~18 h。每种药物作双样品测定，记录无菌生长的最低浓度，观察加入中药提取物以后，盐酸环丙沙星的最小抑菌浓度是否会发生变化。取剩余有抑菌作用的中药提取物，用营养肉汤稀释至亚抑菌浓度后，等体积加入到已经倍比稀释 5个梯度的盐酸环丙沙星中，并设置对照。加液完毕后，充分震荡混匀，于培养箱 37 ℃ 培养 16~18 h。每种药物作双样品测定，记录无菌生长的最低浓度，观察加入中药提取物以后，盐酸环丙沙星的最小抑菌浓度是否会发生变化。

2 结果与分析

2.1 盐酸环丙沙星及中药提取物抑菌效果

盐酸环丙沙星对大肠杆菌 ATCC25922的MIC 为 2 µg/ml，对临床分离大肠杆菌 A-3的MIC为 512 µg/ml，即 A-3对乳酸环丙沙星表现出了高水平耐药。

从30味60种中药的水煎剂与醇提液中筛选出对大肠埃希菌有抑菌作用的有牡丹皮醇提与水煎剂、山楂醇提液与水煎剂、金银花醇提液与水煎剂等 45种中药提取物（见表 1）。本试验所选中药中，以胡椒和山楂醇提液抑菌活性最强，其MIC为 31.25 mg/ml，而山楂水煎剂也表现出良好的抑菌作用，其MIC为62.5 mg/ml。

表1 单味中药提取物对耐药菌株A-3和质控均株ATCC25922 MIC （mg/ml）

部分中药提取物的水煎剂和醇提液的抑菌效果不同，其中淫羊藿、夏枯草的水煎剂具有抑菌作用而醇提液无抑菌作用；茵陈、马鞭草等 3味中药的醇提液具有抑菌效果而水煎剂无抑菌作用，但抑菌范围均在250~500 mg/ml范围内。

所选 60种中药提取物中，临床分离多重耐药大肠杆菌 A-3对苍耳子水煎剂、天仙子醇提液与水煎剂、藿香水煎剂、桑白皮醇提液 4种中药提取物产生了耐药性，其中以苍耳子水煎剂最为严重，其对质控大肠埃希菌MIC为7.8125 mg/ml而对耐药菌MIC为250 mg/ml。临床分离菌对其他中药提取物并未产生耐药，MIC基本一致。

2.2 中药提取物联合盐酸环丙沙星抑菌效果

本试验采用中药提取物与盐酸环丙沙星联合应用，通过观察盐酸环丙沙星对高水平耐药菌株大肠杆菌 A-3的 MIC是否存在影响来判断该中药提取物对大肠杆菌的耐药性是否存在抑制作用，其中地黄等 42种中药取物与盐酸环丙沙星联用后，盐酸环丙沙星对耐药大肠杆菌 A-3 MIC大于 512 µg/ml，表现为拮抗作用；桑白皮等 16种中药提取物与盐酸环丙沙星联用后，盐酸环丙沙星对耐药大肠杆菌A-3MIC等于512 µg/ml；而细辛中药提取物与盐酸环丙沙星联用，可使其MIC下降8倍，表现出良好的耐药抑制作用（见表 2）。

表2 添加细辛提取物后盐酸环丙沙星对耐药菌株A-3 MIC变化 （µg/ml）

3 讨论

3.1 中药有效成分提取

就传统中药提取工艺而言，中药有效成分的提取包括水提法和醇提法：其中热水浸提法即煎煮法，为中药有效成分提取最常用的方法之一；乙醇提取法适用于含杂质较多的药材，乙醇提取法又分为渗漉法和回流法。而现代提取分离技术包括膜分离技术、超临界流体萃取法、超微粉碎技术、分子蒸馏法、超声提取法等。本试验采用传统中药提取法联合应用，首先采用醇提法，在此基础上再采用水煎法，每一味中药材经过 2种处理方法均得到 2种中药有效成分提取液，最大限度的保证了药品成分不丢失。

3.2 中药对大肠杆菌的抑菌作用

研究证实单味中药及一些复方中药在抗菌方面具有独特优势。抗菌中药有着广泛的筛选范围，如清热解毒药、泻下药、补虚药、理血药等。2020年，向双云等检测了黄芩、五味子、黄柏等 8种中草药对大肠杆菌的抑制作用，结果发现其中黄连、鱼腥草、五味子和艾草 4种中药对大肠杆菌表现出较强的的抑菌效果[1]。2021年，胡安古丽·努尔别克等试验发现，骆驼蓬子、没食子对犊牛腹泻致病菌有较好的抑菌作用[2]。本试验选取的30味常见中药中有45种中药提取物对临床分离耐药大肠杆菌存在抑菌作用，除苍耳子水煎剂、桑白皮醇提液、天仙子醇提液与水煎剂、藿香水煎剂 4种中药提取物产生了耐药性外，耐药大肠杆菌对其余中药提取物均不存在耐药性，表明应用中药提取物发挥抑菌作用存在很大优势。

3.3 中药逆转大肠杆菌耐药

由于抗微生物药物的广泛应用甚至滥用，临床分离大肠杆菌对多种抗微生物药物均产生了耐药，本研究室通过对 2021年沧州地区临床分离大肠杆菌的敏感性试验，其中对恩诺沙星、环丙沙星的耐药率分别为 79.45 %、70.09 %。为解决细菌耐药性带来的影响，2015年，司红彬等人通过白头翁水提取物与抗菌药联合抗含耐磷霉素基因型和超广谱 β-内酰胺酶型大肠埃希菌体外研究，表明白头翁水提取物与 13种抗菌药联合使用，可增强抗菌药抗菌活性，降低抗菌药MIC[3]。2018年，王莉贞等研究发现倒扣草水煮液与部分抗菌药联用可降低抗菌药对多重耐药大肠杆菌的最小抑菌浓度[4]。2020年，刘超怡等人探究了艾叶对大肠杆菌的耐药消除作用，试验发现艾叶提取物在一定程度上能够消除禽源大肠杆菌的耐药性[5]。

本试验通过对临床常见 30味中药材的水煎剂与醇提液与环丙沙星联合试验发现，细辛具有耐药抑制作用，细辛提取物在很大程度上可能是一种天然的外排泵抑制剂，而具体是哪一种成分有效还需进一步分离验证；除此，存在地黄等42种中药取物其与盐酸环丙沙星联用后，盐酸环丙沙星对耐药大肠杆菌 A-3的 MIC大于512 µg/ml，表现为拮抗作用，这说明，尽管目前中西药结合抑菌是国内研究的一个热点，但是多数中药材与喹诺酮类药物联用，表现为拮抗作用，临床应慎用，而其具体拮抗机制有待研究。