线粒体DNA甲基化在阿尔茨海默病中的研究进展

徐营营 程玲 张晓 孙琳 王允 毕建忠

(山东大学第二医院神经内科，山东 济南 250033)

阿尔茨海默病(AD)是以进行性记忆力下降和其他认知功能障碍为特征的一种慢性神经退行性疾病，是导致痴呆的最常见病因。2017年世界卫生组织报告显示，全球约有5 000万痴呆患者，预计到2050年，全世界痴呆患者将超1.31亿，其中约60%～70%为AD患者〔1〕。据统计，2015年中国AD患者超过700万人，总花费超1.1万亿元，预计到2030年将达3.4万亿元，2050年将达到12.7万亿元〔2〕。随着我国人口老龄化的加剧、AD患病率的增加，给家庭和社会带来了极大的压力和沉重的经济负担〔2〕。因此，深入探讨AD的发病机制、积极寻找新的治疗药物，具有重要的科研价值、经济效益和社会意义。

1 线粒体功能障碍与AD

尽管神经病理学研究表明，β-淀粉样蛋白(Aβ)在AD发病中起核心作用，但是，AD具有复杂的病因和发病机制，到目前为止尚未完全明确。目前研究发现，AD的发病机制主要包括基因突变、Aβ级联反应学说、tau蛋白学说、神经炎症反应与氧化应激学说、神经血管学说、线粒体功能障碍假说等〔3,4〕。

越来越多研究表明，线粒体功能障碍通过多种方式参与AD发病，包括线粒体DNA(mtDNA)的突变与缺失、线粒体生物合成功能障碍、线粒体自噬异常、线粒体动力学改变等方式〔4,5〕。线粒体基因的改变和损伤引起的线粒体功能障碍被认为是AD发病的主要机制之一〔6〕。最近研究表明，线粒体基因存在表观遗传学改变，在许多线粒体功能障碍相关的疾病中发挥重要作用，因此，有学者提出，线粒体表观遗传学可能是导致AD的一种潜在发病机制〔7〕。

2 DNA甲基化与AD

表观遗传学是指在有丝分裂或减数分裂中可遗传的基因功能的改变，这些变化不能用DNA序列改变来解释〔8〕。主要的表观遗传学修饰模式包括DNA碱基的共价修饰(包括DNA甲基化、羟甲基化、醛基化和羧基化修饰)、组蛋白变异、组蛋白的翻译后修饰、RNA修饰和非编码RNA(ncRNA)等〔9〕。其中，DNA甲基化作为一种重要的表观遗传学模式，在生长、发育及调控基因表达等方面发挥重要作用〔10〕。DNA甲基化主要是指在DNA甲基转移酶(DNMTs)的催化作用下，甲基从S-腺苷甲硫氨酸(SAM)转移到胞嘧啶的第5位碳原子上，使之变成5-甲基胞嘧啶(5mC)的共价修饰模式。在细胞核中，胞嘧啶甲基化主要发生在位于胞嘧啶-磷酸-鸟嘌呤(CpG)岛内的CpG双核苷酸中〔8,10〕。DNA甲基化导致DNA分子结构发生改变，影响转录因子、RNA聚合酶、拓扑异构酶或抑制蛋白与DNA结合，从而导致基因转录和表达功能障碍〔11〕。DNA甲基化与许多疾病密切相关，包括肿瘤、动脉粥样硬化、神经退行性疾病、精神分裂症、癫痫、自身免疫性疾病等多种疾病〔10〕。目前，人外周血中DNA甲基化检测已经开始用于癌症患者的早期筛查和诊断。

既往多个研究发现，在AD中全基因组DNA甲基化水平及多个候选基因的甲基化水平存在异常改变，但结果并不完全一致，也存在一些相互矛盾的结果〔12,13〕。此外，AD患者外周血中DNA异常甲基化，也可作为AD早期诊断及病情发展的生物学标志物〔13〕。此外，由于DNA甲基化是可逆的，研究DNA甲基化在AD发病中的机制，可以为进一步治疗干预提供新的靶点。

3 线粒体DNA甲基化

线粒体作为细胞内的“动力工厂”，通过氧化磷酸化(OXPHOS)产生三磷酸腺苷(ATP)为细胞提供能量〔7,14〕。线粒体是真核细胞中，除细胞核外，唯一存在遗传物质的细胞器。mtDNA独立于核基因组，以母系、非孟德尔遗传方式〔15〕。人类mtDNA是由富含鸟嘌呤的重链和富含胞嘧啶的轻链构成的双环状结构，大小为16 569 bp〔7〕。mtDNA中唯一的非编码区，又称D环区(D-loop)，长度为1 124 bp，含有mtDNA复制起始点和转录启动子，是mtDNA复制和转录的主要调控区〔16〕。mtDNA的编码区包含13个与电子传递链(ETC)或OXPHOS相关的基因，22个转运RNA(tRNA)基因和2个核糖体RNA(rRNA,包括12S rRNA和16S rRNA)基因。此外，mtDNA还包含一些编码ncRNA的假基因〔17〕。其余1 158个线粒体蛋白质由细胞核基因编码并通过各种途径转运到线粒体中，以维持线粒体的功能〔18〕。线粒体是细胞中的关键细胞器，在细胞能量代谢、产生活性氧(ROS)、血红素生物合成、钙离子信号传导、细胞周期调节、细胞分化和凋亡等许多生物学过程中发挥重要的功能〔7〕。线粒体功能障碍与年龄、肿瘤、心脏病及AD、帕金森病(PD)、亨廷顿病等神经退行性疾病密切相关〔19〕。

关于mtDNA能否甲基化一直存在争议，直到2011年，有研究发现线粒体中存在DNA甲基转移酶(DNMT)1，其含有一个线粒体靶向序列，可以易位到线粒体中，与线粒体D-loop结合，在胞嘧啶甲基化中发挥关键作用，才使得mtDNA甲基化逐渐引起国内外学者的关注〔20〕。后来，其他研究检测到mtDNA中也存在5mC和5hmC，并且在线粒体中发现了其他的甲基化酶，包括DNMT 3A和DNMT 3B〔21〕。mtDNA缺乏具有保护作用的组蛋白和有效的DNA修复系统，因此其对氧化应激比核基因更敏感，易被ROS损伤，而ROS也是导致DNA甲基化的明确诱因〔22〕。虽然人mtDNA只占整个细胞DNA的不足1%，但mtDNA有435个CpG位点和4 747个非CpG位点的胞嘧啶，与核基因不同，mtDNA没有经典的CpG岛〔23〕。尽管目前还有一些争议，但多数学者认为mtDNA的CpG位点、非CpG位点(包括CpA、CpT和CpC)的胞嘧啶和腺嘌呤均可发生甲基化〔24〕。但是，mtDNA发生甲基化和去甲基化的具体机制尚不清楚〔18〕。与核DNA相比较而言，mtDNA整体甲基化程度较低，有学者提出，线粒体D-looP平均甲基化水平约小于等于5%〔25〕。尽管缺乏直接证据，但mtDNA甲基化很可能通过调节mtDNA的复制和基因表达水平在许多病理生理过程中发挥重要作用〔26〕。

4 AD中mtDNA甲基化的研究

近年来，多项研究表明，mtDNA甲基化与年龄、环境污染、药物及许多疾病相关，包括肌萎缩侧索硬化(ALS)、PD、AD、糖尿病视网膜病变、非酒精性脂肪肝、肿瘤、心血管疾病等〔9,21,27～31〕。mtDNA甲基化有望成为疾病的一种重要的生物学标志物和诊断工具，但目前对mtDNA甲基化参与疾病发病具体机制的相关研究较少，mtDNA甲基化是疾病的病因还是疾病的结果，目前也尚未明确〔18〕。

线粒体功能障碍是许多神经退行性疾病的一个重要特征，有学者提出AD中的线粒体功能障碍也可以通过mtDNA异常甲基化来部分解释〔32〕。近几年的相关研究也表明，mtDNA甲基化与AD、PD、ALS等多种神经退行性疾病相关，但仅限于少数几项研究中〔33～35〕。在AD中，mtDNA甲基化的研究才刚起步。Blanch等〔34〕研究发现，8例AD患者脑标本中，内嗅皮层的线粒体D-loop甲基化水平升高，而线粒体ND1基因甲基化水平降低。而在3月龄、6月龄和12月龄的AD小鼠模型，即淀粉样前体蛋白/早老素(APP/PS)1双转基因小鼠的大脑新皮质中，检测发现线粒体D-loop甲基化水平随着疾病进展，呈现出先升高后降低的动态变化。Stoccoro等〔33〕研究了133例晚发型AD(LOAD)和130例对照者外周血中线粒体D-loop的甲基化水平，发现LOAD患者的外周血中线粒体D-loop甲基化水平较对照组明显下降。而既往我们研究发现，9月龄的AD小鼠海马中，线粒体12S rRNA基因甲基化水平较对照组小鼠升高，推测mtDNA甲基化可能在AD发病中起重要作用〔36〕。而AD中线粒体其他基因甲基化的研究较少，mtDNA甲基化与AD的关系尚不完全明确，且mtDNA甲基化是AD中线粒体功能障碍的病因还是结果，及mtDNA甲基化影响AD发病的具体机制，还有待于进一步研究证实。近年来，随着DNA甲基化编辑技术的发展，针对特定CpG位点进行精确的靶向甲基化修饰，将有助于对mtDNA甲基化的具体生理功能和病理机制进行更深入的研究，进而为探讨AD的发病机制提供新的方向〔37〕。此外，由于表观遗传修饰的可逆性，mtDNA甲基化的研究为AD中线粒体功能障碍的治疗干预提供了新的途径。

总之，mtDNA甲基化作为近年的一个新的热点，其研究尚处于起始阶段。有学者提出，mtDNA甲基化可能是导致AD的一种潜在的发病机制。但目前为止，只有几项研究检测了AD患者脑标本、外周血及AD动物模型中mtDNA甲基化的变化，且多集中于D-loop，还需要进一步研究来阐明mtDNA甲基化的生物学意义及其与AD的因果关系。