流感样病例中肺炎支原体感染与耐药情况研究

涂鹏，窦海伟，史大伟，宛瑞杰，田秀君，袁青，陈小华，辛德莉

肺炎支原体（mycoplasma pneumoniae，MP）是引起急性呼吸道感染（acute respiratory infection，ARI）的常见病原体，以发热、咳嗽为主要表现，部分患者可出现肺外并发症，危及生命。近年来临床出现大环内酯类药物耐药现象，导致患者发热、咳嗽和治疗周期延长［1-2］。由于临床症状及血常规检测指标与流行性感冒（以下简称“流感”）类似［3］，叶久红等［4］对2015—2017年武汉市某三级甲等医院1 197例流感样病例（influenzalike illness，ILI）中MP进行检测，发现MP阳性率为14.54%。因此，本研究对2018—2020年我国北方地区冬季（2018年12月至2019年2月、2019年12月至2020年2月）ILI咽拭子标本进行流感病毒抗原、MP核酸及MP耐药基因检测，以期更好地了解ILI中流感病毒和MP感染及耐药情况，现报告如下。

1 对象与方法

1.1 研究对象 收集2018年12月至2019年2月、2019年12月至2020年2月潍坊、开封、哈尔滨、内蒙古、北京、天津、铜川、咸阳、秦皇岛、丹东、汉中、太原、本溪地区各1家，漯河地区2家，南阳地区2家，总共17家三级甲等医院门诊就诊的915份ILI的咽拭子标本。纳入标准：以《全国流感监测方案（2017年版）》［5］中ILI为标准，即发热（体温≥38 ℃），伴咳嗽或咽痛之一者。排除标准：（1）病程＞72 h；（2）有明确细菌感染或明确诊断为其他疾病的患者；（3）新型冠状病毒肺炎（COVID-19）阳性。

1.2 研究方法

1.2.1 咽拭子标本采集 采集咽拭子标本采用尼龙材质植绒拭子，所有入组病例同时采集2支咽拭子，一支立即进行流感病毒抗原检测并记录结果，另一支放入咽拭子管中，置于-80 ℃或-20 ℃冰箱中冷冻保存，标本统一经冷链运输到中心实验室，集中进行MP核酸及耐药基因检测。

1.2.2 流感病毒抗原检测 采用甲型/乙型流感病毒抗原检测试剂盒（胶体金法）（杭州创新科技生物有限公司，生产批号：AB180204/GB191003/GF200104），将采集的咽拭子浸在采样管样本抽提液中搅拌。从采样管外侧用手指挤压棉棒数次，使样本抽提液充分浸透棉棒，然后拔出棉棒，绞出液体进行检测。15min后观察结果。

1.2.3 核酸提取 采取DNA/RNA病毒核酸提取试剂盒（北京卓诚惠生生物科技股份有限公司，生产批号20200312）。将采集的咽拭子充分搅拌混匀，取200 µl样本加入到1.5 ml离心管中，加入10 µl蛋白酶K，6 µl Carrier RNA，再加入200 µl裂解液，旋涡震荡混匀15 s，室温静置5 min；加入400 µl无水乙醇，震荡15 s，室温静置5 min；将混合液转移至离心柱中，12 000 rpm离心1 min；将离心柱放入新的收集管中，向离心柱中加入500 µl洗涤液，盖上管盖，12 000 rpm离心30 s；将离心柱放入新的收集管中，向离心柱加入500 µl漂洗液，盖上管盖，12 000 rpm离心30 s；将离心柱放入新的收集管中，12 000 rpm离心3 min；将离心柱放入新的RNase-Free离心管（1.5 ml）中，打开离心柱管盖，室温放置10 min，加入100 µl洗脱液，盖上盖子，室温放置3 min，12 000 rpm离心1 min，收集洗脱液，放入-80 ℃冰箱保存，以备后续实验检测。

1.2.4 MP及其耐药基因检测 应用荧光定量聚合酶链式反应（PCR）法扩增ILI标本MP的23SrRNA基因，上游引物序列5'-GACACCCGTTAGGCGCAA-3'，下游引物序列5'-CTGGATAACAGTTACCAATTAGAACAGC-3'，目的片段长度为186 bp。反应体系：5×Prime STAR Buffer 10 µl，dNTP Mix 4 µl， 上 下 游 引 物 各 2 µl，高保真酶 0.25 µl，模版 DNA 5 µl。DEPC 水 27 µl。反应条件：98℃变性2 min；98℃ 10 s、55℃ 10 s、72℃ 1 min，共35个循环；72℃延伸10 min。将PCR产物送至生工生物工程（上海）股份有限公司应用DNA直接测序法测序，测得序列与美国国立生物技术信息中心（National Center for Biotechnology Information，NCBI）已登录的标准株23SrRNA基因进行比对［6］。

1.3 统计学方法 采用SPSS 20.0软件进行统计学分析。正态分布的计量资料以（±s）表示；计数资料以相对数表示，组间比较采用χ2检验或 Fisher's确切概率法。以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 一般资料 915份ILI标本中男性标本425份，女性标本490份。儿童标本（＜18岁）578份，其中男性标本285份，女性标本293份；年龄0～18岁，平均（5.0±3.0）岁。成人标本（≥18岁）337份，其中男性标本140份，女性标本197份；年龄18～74岁，平均（37.6±13.6）岁。

2.2 流感病毒抗原检测结果 915份ILI标本中流感病毒抗原检测阳性率为45.25%（414/915），其中单纯甲型流感病毒占91.06%（377/414），单纯乙型流感病毒占8.94%（37/414），未见甲型、乙型流感病毒混合感染病例。儿童ILI标本中流感病毒抗原检测阳性率为44.29%（256/578），其中单纯甲型流感病毒占91.80%（235/256），单纯乙型流感病毒占8.20%（21/256）［7］；成人ILI标本中流感病毒抗原检测阳性率为46.88%（158/337），其中单纯甲型流感病毒占89.87%（142/158），单纯乙型流感病毒占10.13%（16/158）；儿童流感病毒抗原检测阳性率与成年人比较，差异无统计学意义（χ2=0.577，P=0.447）。

2.3 MP及其耐药基因检测结果 915份ILI标本中MP阳性率为11.91%（109/915），其中儿童ILI标本中MP阳性率为4.34%（25/578），成人ILI标本中MP阳性率为24.93%（84/337）；成人ILI标本中MP阳性率高于儿童，差异有统计学意义（χ2=86.094，P＜0.001）。109份MP阳性标本中77.98%（85/109）存在耐药基因位点突变，突变位点为23SrRNA 结构域V区2063 A到G或者2064 A到G，22.02%（24/109）为敏感株，74.31%（81/109）存在A2063G位点突变，1.83%（2/109）存在A2064G位点突变，1.83%（2/109）存在A2063G位点和A2064G位点共同突变。儿童MP阳性标本中48.00%（12/25）存在A2063G位点突变，8.00%（2/25）存在A2064G位点突变，8.00%（2/25）存在A2063G位点和A2064G位点共同突变，36.00%（9/25）为敏感株；成人MP阳性标本中82.14%（69/84）存在A2063G位点突变，17.86%（15/84）为敏感株，未见A2064G位点突变；成人MP A2063G位点突变阳性率高于儿童，差异有统计学意义（χ2=11.765，P=0.001）。

2.4 流感病毒与MP混合感染情况 915份ILI标本中流感病毒与MP混合感染阳性率为2.84%（26/915），其中儿童ILI标本中流感病毒与MP混合感染阳性率为1.73%（10/578），成人ILI标本中流感病毒与MP混合感染阳性率为4.75%（16/337）；成人ILI标本中流感病毒与MP混合感染阳性率高于儿童，差异有统计学意义（χ2=7.022，P=0.008）。915份ILI标本中甲型流感病毒与MP混合感染阳性率为2.40%（22/915），乙型流感病毒与MP混合感染阳性率为0.44%（4/915）。成人ILI标本中甲型流感病毒与MP混合感染阳性率高于儿童，差异有统计学意义〔3.86%（13/337）与1.56%（9/578），χ2=4.801，P=0.028〕； 而 两 组 MP与 乙型流感病毒混合感染阳性率比较，差异无统计学意义〔0.89%（3/337）与0.17%（1/578），P=0.144〕。

3 讨论

流感病毒和MP是ARI的重要病原，任何年龄、任何季节均可发病，我国北方地区以秋、冬季多见［1-3］。甲型和乙型流感每年呈现季节性流行特点，其中甲型流感可引起全球大流行［3，5］。根据国家流感中心发布的流感监测周报［8］，2018—2019年我国北方地区第48周（2018-11-26至2018-12-02）进入流感冬季流行季，2019—2020年我国北方地区第52周（2019-12-23至2019-12-29）进入流感冬季流行季，均以甲型流感为主。本研究915份ILI标本中流感病毒抗原检测阳性率为45.25%（414/915），其中甲型流感病毒占91.06%（377/414），乙型流感病毒占8.94%（37/414），未见甲型、乙型流感病毒混合感染病例。与国家流感中心发布的甲型流感为主的结果一致。MP每3～7年出现地区周期性流行，流行时间可长达1年，流行年份的发病率是非流行年份的数倍［1-2］。由于MP感染的临床表现与流行季节流感类似，叶久红等［4］对2015—2017年武汉市某三甲医院1 197例ILI病原学检测结果分析发现，MP阳性率为14.54%，其中0～13岁年龄组患者MP阳性率为20.53%，14～64岁年龄组患者MP阳性率为0.24%。王海滨等［9］对2017年北京市朝阳区ILI病原谱分析发现MP阳性率为1.51%，5～14岁、15～24岁、25～59岁、＞59岁年龄组患者MP阳性率分别为0、1.83%、1.51%、1.21%。史大伟等［10］对2018—2019年冬、春季北京地区儿童ILI病原学分析发现MP阳性率为1.06%。孔德川等［11］对2015—2017年上海地区成人ARI病原学进行分析发现MP检出阳性率为5.33%，＜60岁成人组MP检出阳性率高于≥ 60岁组。秦迪等［12］对2018年北京市西城区ARI病原学进行分析发现＞14岁组MP阳性率为3.07%，并且MP阳性率在10—12月最高。本研究915份ILI标本中MP阳性率为11.91%（109/915），其中儿童ILI标本中MP阳性率为4.34%（25/578），高于北京地区［9-10］儿童ILI标本中MP阳性率，低于武汉地区［4］儿童ILI标本中MP阳性率；成人ILI标本中MP阳性率为24.93%（84/337），高于现有文献［11-12］的阳性率。MP阳性率差异原因可能与研究标本来源、标本采集时间、患者年龄有关，本研究标本来自河南省、河北省、黑龙江省、山东省、内蒙古自治区等地，标本采集时间多在12月至次年2月，为流感病毒、MP高发季节，超过80%的患者年龄在6～55岁。

MP缺乏细胞壁，临床治疗MP感染主要选择抑制或影响蛋白质和核酸合成的药物，如大环内酯类、四环素类、氟喹诺酮类。儿童处于生长发育期，四环素类、喹诺酮类等抗生素的使用受到限制，因此大环内酯类抗生素作为治疗儿童肺炎支原体肺炎的首选药物。自2001年日本从临床分离出对大环内酯类抗生素耐药的MP菌株［13］以来，全球陆续报道MP耐药情况，我国一直处于较高水平［14］。目前认为23SrRNA耐药突变是MP对大环内酯类药物耐药的主要机制。CAO等［15］对既往大环内酯类抗生素耐药肺炎支原体肺炎的文献进行综述，发现23SrRNA基因A2063G突变最普遍，其次是A2064G，A2063T、A2063C、A1290G、C2617A和A2067G较少见。辛德莉等［16］对MP对大环内酯类抗生素耐药机制研究发现，23SrRNA基因发生A2063G、A2064G位点突变的MP对大环内酯类抗生素的最小抑菌浓度（minimum inhibitory concentration，MIC）均升高。ZHAO等［17］报道2008—2012年北京地区MP耐药阳性率分别为68.9%、90.0%、98.4%、95.4%和97.0%，其中A2063G位点突变率为97.1%，A2064G位点突变率为2.5%，A2063T位点突变率为0.4%。窦海伟等［18］报道2016年北京地区儿童MP耐药阳性率为66%，其中A2063G位点突变率为93.84%，A2064G位点突变率为6.16%。本研究MP耐药阳性率为77.98%，与文献［16-18］报道相似，提示我国MP耐药仍处于较高水平。MP 23SrRNA基因检测中A2063G位点突变率为95.30%（81/85），A2064G位点突变率为2.35%（2/85），A2063G/A2064G位点共同突变率为2.35%（2/85），MP 23SrRNA基因检测中耐药位点突变率与文献［16-18］报道相似，但本研究儿童ILI标本中还发现2份A2063G/A2064G同时突变的标本，提示MP 23SrRNA基因存在多个位点突变的情况。

流感病毒可同时混合其他病毒、支原体、细菌等不同病原感染。部分患者可因出现肺炎等并发症进展为重症流感，出现多脏器功能衰竭而死亡。罗丽娟等［19］对2017—2019年上海地区儿童甲型流感病毒感染的临床特征分析，发现甲型流感病毒与MP混合感染阳性率为3.51%。许东风等［20］对2017年南阳地区临床722例排除细菌感染的急性上呼吸道感染患者进行流感病毒及MP导致呼吸道感染的流行病学特点研究发现，流感病毒与MP混合感染阳性率为3.05%（22/722），＜16岁、16～30岁、＞30～50岁和＞50岁流感病毒与MP混合感染阳性率分别为4.76%、4.62%、0.61%和2.04%。钟慧君等［21］对深圳地区2017年临床1 193例发热患儿进行流感病毒和MP感染的临床特征分析，发现流感病毒与MP混合感染阳性率为7.29%（87/1 193），与单纯MP感染组相比，流感病毒与MP混合感染组患儿出现咳嗽、咳痰症状明显增多；与单纯流感病毒感染组和单纯MP感染组相比，流感病毒与MP混合感染组体温处于中、高热状态的患儿较多，患儿发热时间和住院时间更长，单核细胞百分比和中性粒细胞百分比升高，淋巴细胞百分比降低，IgG、IgA、IgM、C3和C4阳性占比较高。而关于成人流感病毒与MP混合感染的相关报道较少。本研究ILI标本中流感病毒与MP混合感染阳性率为2.84%，儿童ILI标本中流感病毒与MP混合感染阳性率为1.73%，其中甲型流感病毒与MP混合感染阳性率为1.56%。儿童流感病毒与MP混合感染阳性率低于文献［19-21］中的混合感染阳性率，可能与本研究标本来源不同有关。成人ILI标本中流感病毒与MP混合感染阳性率为4.75%（16/337），其中甲型流感病毒与MP混合感染阳性率为3.86%（13/337），与文献［20］报道类似。

综上所述，2018—2020年我国北方地区冬季流感以甲型流感为主。ILI标本中可见MP感染，成人MP阳性率高于儿童。我国MP对大环内酯类耐药率仍处于较高水平，以MP 23SrRNA基因A2063G位点突变最为常见，同时可见A2063G/A2064G位点共同突变。部分患者可见流感病毒与MP混合感染。对于ILI应进行多病原检测，了解ILI的病原分布情况，流感治疗时应兼顾其他病原治疗。对于MP感染的患者应进行MP耐药检测，了解MP耐药情况。充分了解病原分布及耐药情况有助于临床合理用药，降低抗生素耐药性风险。

由于本研究仅纳入了2018—2020年冬季北方17家三级甲等医院门诊ILI标本，无法针对全年的ILI进行分析研究。下一步将开展对于全年不同季节ILI中肺炎支原体感染情况的分析。

作者贡献：涂鹏进行文章的构思与设计，研究的实施与可行性分析，撰写论文；史大伟、宛瑞杰进行数据收集；袁青进行数据整理，统计学处理；窦海伟、田秀君进行结果的分析与解释；陈小华进行论文的修订及英文的修订；辛德莉负责文章的构思、质量控制及审校；涂鹏、辛德莉对文章整体负责，监督管理。

本文无利益冲突。