藤黄酸通过CYLD/NF-κB信号通路抑制高糖环境下RPE细胞上皮-间充质转化的作用△

陈 晶 庞东渤

糖尿病视网膜病变(DR)包括非增殖期DR及增殖期DR(PDR)。PDR的主要表现为病理性新生血管的形成，其发生发展是导致眼底出血及牵拉性视网膜脱离的主要原因[1]。视网膜色素上皮(RPE)细胞为血-视网膜屏障的重要组成部分，对维持视网膜正常生理功能起重要作用。研究表明，糖尿病持续高糖环境可引起核因子κB(NF-κB)过度激活，进而发生严重的氧化应激及炎症反应等，引起RPE细胞氧化损伤及上皮-间充质转化(EMT)， EMT是PDR发展的关键[2-3]。去泛素化酶圆柱瘤蛋白(CYLD)为NF-κB 的主要负性调控因子和炎症抑制因子[4]。藤黄酸(GA)是中药藤黄的主要成分，具有抗炎、抗肿瘤细胞增殖等作用。Chen等[5]研究表明，GA可抑制DR病变过程中炎症反应。CYLD/NF-κB在高糖环境下RPE细胞EMT中的作用以及GA能否抑制EMT过程尚未完全明了。本研究通过体外培养人RPE细胞，基于CYLD/NF-κB信号通路，旨在探讨GA对高糖状态下人 PRE细胞EMT的作用及可能机制。

1 材料与方法

1.1 主要材料及仪器ARPE-19 细胞株(美国 ADCC 细胞库，CRL-2302)。1640 培养基(美国 HyClone 公司)；GA(中国瑞芬思生物公司)； CCK-8试剂盒、兔抗人磷酸化核转录因子κB(p-NF-κB)多克隆抗体(中国万类生物公司)；CYLD、α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)抗体(中国博士德公司)。Mini-REPOTEANⅡ型电泳槽、Biocell 2010酶标仪(奥地利Anthos Labtec Instruments公司)；化学发光凝胶系统分析仪(美国UVP公司)；Leica4000B正置荧光显微镜(德国Leica公司)。

1.2 方法

1.2.1 ARPE-19细胞传代培养将ARPE-19 细胞快速复苏后移至25 cm2培养瓶中，在含体积分数 5% CO2、37 ℃饱和湿度的无菌培养箱中进行培养，隔天换液，观察RPE细胞生长情况。当RPE细胞长满至培养瓶底面 80%左右时，以含EDTA的复合消化液消化，直至RPE细胞全部处于悬浮状态。将RPE细胞悬液分装到两个离心管中，以2000 r·min-1离心3 min，弃上清，分别加入5 mL完全培养基，接种在两个新的培养瓶中，摇匀并做好标记，隔天观察并且按时换液和传代。待RPE细胞状态良好、生长至融合状态后，胰蛋白酶消化传代。实验用3～5代RPE细胞。

1.2.2 实验分组及药物处理将培养后的RPE细胞分为NC组(含5.5 mmol·L-1葡萄糖)，HG组(含30 mmol·L-1葡萄糖)，HG+不同剂量GA组(2 μmol·L-1、4 μmol·L-1、8 μmol·L-1GA分别预处理RPE细胞1 h，加30 mmol·L-1葡萄糖)。

1.2.3 CCK-8检测各组RPE细胞增殖活力胰蛋白酶消化RPE细胞，加培养液制成单个RPE细胞悬液并计数，以每孔300个RPE细胞接种至96孔板，每孔100 μL，贴壁培养 24 h，吸去上清，加无血清培养基，培养24 h，促进细胞进一步分化。观察不同浓度GA对高糖诱导的RPE细胞增殖的作用，并设高渗透压对照组(含5.5 mmol·L-1葡萄糖+19.5 mmol·L-1甘露醇，MG组)。

按实验分组中不同的处理方法作用RPE细胞48 h，每组设 6个复孔。每孔加入CCK-8试剂10 μL，轻轻摇晃96孔板后放入37 ℃、体积分数为5%CO2培养箱中继续培养1 h，取出96孔板置于酶标仪上，490 nm处测定各孔吸光度(OD)值。

1.2.4 免疫荧光染色检测RPE细胞中α-SMA、CYLD的表达各组RPE细胞分别按1.2.2中分组方法处理后24 h，吸去培养液，PBS洗3次，每次1 min；40 g·L-1多聚甲醛固定30 min，PBS 洗3次，每次1 min；3 g·L-1Triton X-100作用 30 min，PBS洗3次，每次1 min；室温下山羊血清工作液封闭60 min；加α-SMA、CYLD一抗，置于湿盒内4 ℃ 孵育过夜，PBS洗3次，每次1 min；用异硫氰酸荧光素标记的二抗室温孵育1 h，DAPI染核5 min，PBS洗3次，每次1 min；封片，荧光显微镜观察并拍照。

1.2.5 Western blot检测RPE细胞中α-SMA、CYLD、p-NF-κB蛋白表达各组RPE细胞分别按1.2.2中分组方法处理后24 h，PBS洗3次，每次1 min。立即放入预冷的裂解液中， 4 ℃ 12 377 r·min-1离心，取上清，BCA法进行蛋白质定量。每个泳道蛋白上样量为20 μg，行 SDS-PAGE凝胶电泳，观察Marker移动情况。将凝胶中的蛋白质转移至硝酸纤维素膜上，室温封闭1 h，分别加兔抗大鼠α-SMA一抗、兔抗大鼠CYLD一抗、兔抗大鼠p-NF-κB一抗，4 ℃ 孵育过夜，TBST洗膜3次，每次10 min；将硝酸纤维素膜放入山羊抗兔二抗(11000) 中，室温孵育1 h，TBST洗膜3次，每次10 min。行ECL化学发光显影。利用Visionworks 6.3.3图像采集及分析软件对蛋白条带进行分析。实验重复3次，取蛋白条带平均数值。定量检测RPE细胞中α-SMA、CYLD、p-NF-κB蛋白表达。

2 结果

2.1 GA对RPE细胞增殖的影响CCK-8检测结果显示：与NC组相比，HG组RPE细胞出现明显增殖(P<0.01)，而 MG组RPE细胞无明显变化(P>0.05)，提示高糖诱导可促进RPE细胞的增殖，而与渗透压无关；与HG组相比，HG+不同剂量GA组预处理后，明显抑制RPE细胞增殖(均为P<0.05)，且呈剂量依赖性下降。

2.2 GA对高糖诱导的RPE细胞α-SMA表达的影响免疫荧光染色检测结果显示：红色荧光为α-SMA，蓝色荧光为细胞核。与NC组相比，HG组RPE细胞中α-SMA表达明显增强；与HG组相比，HG+不同剂量GA组RPE细胞中α-SMA表达均明显减弱，且呈剂量依赖性下降(图1)。

Western blot检测结果显示：与NC组相比，HG组RPE细胞中α-SMA表达明显增加(P<0.01)；与HG组相比，HG+不同剂量GA组RPE细胞中α-SMA表达均减少(均为P<0.05)，且呈剂量依赖性下降(图2)。

图2 GA对高糖诱导的RPE细胞中α-SMA表达的影响 与NC组相比，**P<0.01；与HG组相比，#P<0.05，##P<0.01。1:NC组;2:HG组;3:HG+ 2 μmol·L-1GA组;4:HG+ 4 μmol·L-1GA组;5:HG+8 μmol·L-1 GA组。

2.3 GA对高糖诱导的RPE细胞中CYLDN蛋白表达的影响免疫荧光染色检测结果显示：红色荧光为CYLD，蓝色荧光为细胞核。与 NC 组相比，HG组RPE细胞中CYLD蛋白表达明显减弱；与HG组相比，HG+不同剂量GA组RPE细胞中CYLD蛋白表达均明显增强，且呈剂量依赖性上升(图3)。

图3 各组RPE细胞CYLD表达(×200) A：NC组;B：HG组;C：HG+2 μmol·L-1 GA组;D：HG +4 μmol·L-1 GA组;E：HG+8 μmol·L-1 GA组。

Western blot检测结果显示：与NC组相比，HG组RPE细胞中CYLD表达明显减少(P<0.05)；与HG组相比，HG+不同剂量GA组RPE细胞中CYLD表达均增加(均为P<0.05)，且呈剂量依赖性上升(图4)。

图4 GA对高糖诱导的RPE细胞中CYLD蛋白表达的影响 与NC组相比，*P<0.05； 与HG组相比，#P<0.05。1:NC组;2:HG组;3:HG+2 μmol·L-1 GA组;4:HG+4 μmol·L-1 GA组;5:HG+8 μmol·L-1 GA组。

2.4 GA对高糖诱导的RPE细胞中p-NF-κB蛋白表达的影响Western-blot检测结果显示：与NC组相比，HG组RPE细胞中p-NF-κB蛋白表达明显增加(P<0.01)；与HG组相比，HG+不同剂量GA组RPE细胞中p-NF-κB蛋白表达均减少，且呈剂量依赖性下降(图5)。

图5 GA对高糖诱导的RPE细胞p-NF-κB蛋白表达的影响 与NC组相比，**P<0.01； 与HG组相比，#P<0.05，##P<0.01。1:NC组;2:HG组;3:HG+ 2 μmol·L-1 GA组;4:HG+ 4 μmol·L-1 GA组;5:HG+ 8 μmol·L-1 GA组。

3 讨论

PDR 的主要病理表现是病理性新生血管的形成，因新生血管壁通透性异常，渗漏增多，诱发PDR晚期视网膜内纤维组织增生，形成纤维性视网膜增殖膜，其收缩可引起牵拉性视网膜脱离，对DR患者视觉功能造成永久性的损伤[6]。有研究表明[3]，RPE细胞增殖、迁移及EMT在PDR的发生发展过程起着重要作用，EMT为PDR发展的关键，有效抑制RPE细胞增殖，EMT对PDR患者具有重要的临床意义。

EMT是上皮细胞失去上皮特性而获得间质细胞表型的一种生物现象，可表现为RPE细胞转化为巨噬细胞及成纤维细胞等,发生EMT，参与增殖膜的形成，严重影响PDR患者的预后。α-SMA是成纤维细胞特异性标志物，正常情况下，其在平滑肌细胞和心肌细胞表达，在RPE细胞不表达，但病理状态下转分化的RPE细胞则出现表达，为RPE细胞转分化为间质样细胞的特异性指标[7]。本研究结果表明，应用30 mmol·L-1葡萄糖作用RPE细胞 24 h，RPE细胞出现明显增殖，同时α-SMA表达明显增加，提示高糖可诱导RPE细胞增殖及EMT的发生，与王芳等[8]研究结果基本一致。本研究结果表明，经不同剂量GA预处理后，明显抑制RPE细胞增殖，且α-SMA表达明显减少，提示GA对高糖环境下RPE细胞增殖及EMT具有抑制作用。

目前，研究表明，PDR的发生有多种因素参与，其中NF-κB等炎症因子的产生在其发生发展中起着重要作用[9]。NF-κB 信号调节机制复杂，研究表明[4]，去泛素化修饰参与了NF-κB 信号的调节过程，其中，CYLD是 NF-κB 的主要负性调控因子和炎症抑制因子。有研究表明[10]，高糖可激活肾系膜细胞NF-κB信号通路而介导下游炎症因子表达，参与肾脏炎症的发生，而肾系膜细胞NF-κB信号的激活与高糖下调CYLD表达有关。我们前期研究显示， NF-κB过度活化，促进高糖诱导的RPE 细胞氧化损伤及纤维化发生。本研究结果表明，30 mmol·L-1葡萄糖诱导RPE细胞中p-NF-κB蛋白表达明显增加，同时CYLD蛋白表达减少，提示NF-κB的活化可能与CYLD下调有关，不同剂量GA预处理后，CYLD表达均出现增加，同时p-NF-κB蛋白表达减少，α-SMA表达明显减少。推测GA对高糖环境下RPE细胞EMT的抑制作用可能与上调CYLD表达，抑制NF-κB活化有关。

GA为中药藤黄的重要组成成分，其在抗肿瘤方面的研究较多，包括诱导肿瘤细胞凋亡、抑制肿瘤细胞增殖及新生血管形成等。本研究通过体外培养RPE细胞，高糖诱导，应用不同剂量GA干预，发现GA对高糖诱导的RPE细胞增殖及EMT具有抑制作用，其作用与上调CYLD表达，从而抑制NF-κB的活化有关。