白肋烟与茄子嫁接对烟叶生物碱等化学成分含量和感官质量的影响

杨淳婷，冯雨晴，李玉静，赵园园，张梦玥，周骏，顿松阳，王雪芬，史宏志

(1.河南农业大学烟草学院/烟草农业减害研究中心/烟草行业烟草栽培重点实验室，河南 郑州 450002； 2.上海烟草集团有限责任公司北京卷烟厂，北京 100024；3.河南省烟草公司许昌市公司襄城县分公司，河南 许昌 461700)

生物碱是烟草属(Nicotiana)植物一类重要化学成分，其中烟碱占总生物碱含量的90%以上[1]。烟碱具有较强的生物活性，是烟叶和烟气中重要的生理活性成分，可通过血液进入脑细胞，进而产生生理反应[2]，被普遍认为是吸烟者产生吸烟冲动和对烟草产生依赖性或致瘾性的核心成分，因而国际社会试图通过降低烟叶中的烟碱含量降低烟草消费[3]，近年来国际烟草界关注的热点是把烟碱含量降低致使人上瘾的阈值以下[4]。烟叶的烟碱含量主要受遗传、生态、农艺等措施的影响，低烟碱及超低烟碱烟叶的生产途径主要有农艺措施调控、常规育种和遗传工程等[5]。利用自然变异育成的低烟碱品系LAB21，其烟碱含量仍高于提出的限定标准，且烟株农艺性状和烟叶化学成分与常规的正常烟碱含量烟叶相比有一定的变化[6-8]，除此之外，通过敲除、沉默基因等分子手段调控烟碱合成的关键基因，可以使烟叶烟碱含量降至极低水平，但鉴于转基因烟草应用的限制，还难以在实际生产中应用[9-11]。

嫁接技术已经广泛应用在园艺作物，尤其是瓜果、蔬菜类作物上[12-15]。优良砧木或接穗可以显著促进嫁接植物生长，提高其抗逆性及果实产量和品质，是一种绿色安全可持续的方法[16]。嫁接可提高嫁接苗青枯病的抗性，延缓烟草青枯病的发生[17-18]。DAWSON[19]通过嫁接手段证明了烟草烟碱的合成部位位于根部。史宏志教授课题组前期研究表明，烤烟与茄子嫁接可生产出烟碱含量极低的烟叶，且调制后烟叶特有亚硝胺(tobacco specthfic N-nitrosamines,TSNAs)含量显著降低，但烟叶成熟变慢，劲头明显下降，消费者愉悦感、满足感、接受度显著降低，烤烟与茄子嫁接后碳氮分配和碳氮代谢可能发生变化[20]。此外，通过白肋烟和烤烟嫁接可显著提高白肋烟氮代谢能力[21]，现有研究证实了应用嫁接技术调控烟叶物质含量的可行性。

白肋烟是世界第二大烟草类型，采用晾制方法调制而成，因其组织结构疏松、弹性好、填充力强及香气量足，而成为混合型卷烟的主要原料[22]，生产低/超低烟碱混合型卷烟不仅需要低烟碱烤烟，也需要低烟碱白肋烟烟叶。目前，已有研究通过烟茄嫁接的方法生产出超低烟碱烤烟，而通过烟茄嫁接技术生产超低烟碱白肋烟的研究未见报道。据此，本研究选取白肋烟品种鄂烟1号和紫皮茄子为材料进行嫁接处理，研究白肋烟与茄子种间嫁接降低生物碱含量的可行性及效果，以期为通过农业措施大幅度降低白肋烟烟碱含量和生产超低烟碱混合型卷烟提供新途径。

1 材料与方法

1.1 试验地点与材料

试验于2021年在河南省许昌市襄城县紫云镇塑料大棚(长40 m，宽8 m，高2 m)进行，以白肋烟品种鄂烟1号(由湖北烟草公司提供)和紫皮茄子(茄苗购于襄城县农贸市场)为材料，鄂烟一号采用漂浮育苗的方式育苗。试验地有机质为15.65 g·kg-1，速效钾为146.43 mg·kg-1，速效磷为25.82 mg·kg-1，碱解氮为78.76 mg·kg-1，pH值为7.53。

1.2 试验设计

烟株长至5～6片真叶时，挑选长势均匀一致且茎部没有木质化的茄子苗和烟苗，采用斜切接法进行嫁接。用刀片在距茄子苗或者烟苗根部5～6 cm处斜切，斜面长为1～1.5 cm，角度约为30°，斜切面以下部分作为砧木。用刀片斜切取烟苗顶端2～3片真叶作为接穗，将接穗与砧木贴合在一起，用圆口嫁接夹(塑料材质)固定好。嫁接苗前3 d避光处理，7 d后正常管理。2021-04-30嫁接，2021-05-14移栽，2021-07-20打顶，行株距为1.20 m×0.50 m，施氮量为150 kg·hm-2，肥料为烟草专用复合肥(m(N)∶m(P2O5)∶m(K2O)=15∶15∶15)、硫酸钾、硝酸钾、过磷酸钙。在烟株整个生长过程中，嫁接口不能被土壤覆盖，且要及时去除茄子生长出的腋芽，其他栽培管理措施及病虫害防治均按照当地优质烟生产技术方案。

试验共设3个处理，T1：正常生长的白肋烟鄂烟一号；T2：白肋烟自嫁接(接穗和砧木都是鄂烟1号)；T3：白肋烟与茄子嫁接(以鄂烟1号为接穗，紫皮茄子为砧木)。试验采用随机区组设计，每个小区15株，重复3次，共135株烟。

鲜烟样：在嫁接后60、90 d，取各处理中、上部叶，用液氮速冻后，将样品放在真空冷冻干燥机(LGJ-10，北京松源华兴科技发展有限公司)中冷冻干燥，然后经研磨后过25.4 mm筛用于硝酸盐、生物碱和化学成分测定。

调制后样：烟叶正常成熟采收，各处理选取中部叶、上部叶，编竿后挂牌标记，统一晾制。晾制结束后的样品一部分经冷冻干燥后，研磨过25.4 mm筛，用于硝酸盐、生物碱、化学成分、TSNAs、氨基酸含量测定；另一部分样品切丝卷制成试验卷烟，用于感官质量评价。

1.3 测定项目和方法

1.3.1 农艺性状的测定 在嫁接后45和80 d，各处理分别选择5株有代表性的烟株，用软尺测量其株高、茎围、有效叶数及最大叶长和叶宽。

1.3.3 TSNAs的测定 样品送至上海烟草集团北京卷烟厂进行TSNAs测定，测定方法为在线SPE-液相色谱质谱联用(SPE-LC-MS/MS)法(SPE-LC：Spark Holland，Symbiosis(Pico)；MS/MS：AB Sciex triple quad 5500)。称取1.0 g样品放入50 mL锥形瓶中，加入4种氘代TSNAs(内标)溶液(5 000 ng·mL-1)40 μL和100 mmol·L-1乙酸铵溶液30 mL，室温下振荡(200 r·min-1)萃取60 min，萃取液过0.45 μm水相滤膜，LC-MS/MS检测烟草特有亚硝胺(tobacco-specific nitrosamines，TSNAs)。N-亚硝基降烟碱(NNN)、4-(甲基亚硝胺)-1-(3-吡啶基)-1-丁酮(NNK)、N-亚硝基假木贼碱(NAB)和N-亚硝基新烟碱(NAT)的含量总和为总TSNAs[25-26]。

1.3.4 氨基酸含量的测定 取调制后中部叶烘干、研磨、过筛后，采用高效液相色谱法，在苏州科铭生物技术有限公司进行测定。

1.3.5 感官质量评价 由国家烟草栽培生理生化研究基地和河南中烟工业有限责任公司等单位评吸专家按照河南中烟工业有限责任公司感官评价方法分别进行感官品质评价。按照香气质、香气量、杂气、浓度、劲头、刺激性、余味、燃烧性共8个单项指标打分。

2 结果与分析

2.1 白肋烟与茄子嫁接对白肋烟烟株农艺性状的影响

对不同处理间烟株农艺性状结果分析可知，各处理的叶长、叶宽、株高、茎围、有效叶数差异均不显著，白肋烟与茄子嫁接后烟株长势没有显著变化(表1)。嫁接后45 d，叶长、叶宽、茎围以T1处理较大，株高以T3处理较大。嫁接后80 d，叶长、叶宽、株高、茎围以T1处理较大，且T1与T2处理的最大叶长、叶宽均大于T3处理。表明嫁接处理对白肋烟烟株生长以及形态建成影响较小。

2.2 白肋烟与茄子嫁接对白肋烟生物碱含量的影响

2.2.1 白肋烟与茄子嫁接对鲜烟叶生物碱含量的影响 对鲜烟叶生物碱含量分析可知，烟茄嫁接后白肋烟鲜烟叶生物碱含量显著降低，成熟期烟碱含量降低至0.079 8%，且未检测出降烟碱和新烟草碱(表2)。嫁接后60 d，各处理烟碱、降烟碱、假木贼碱、新烟草碱以及总生物碱含量存在显著差异；与T1处理相比，T2处理烟碱、总生物碱含量分别升高65.69%%、65.89%，T3处理的烟碱、总生物碱含量分别降低94.81%、95.10%。嫁接后90 d，与T1相比，T2处理烟碱、降烟碱、假木贼碱、新烟草碱及总生物碱含量无显著差异，T3处理烟碱、假木贼碱及总生物碱含量降低，其中T3处理烟碱、总生物碱含量较T1处理分别降低97.35%、97.33%。上述结果表明，以茄子为砧木、白肋烟为接穗能有效降低鲜烟叶生物碱含量。

表1 白肋烟与茄子嫁接对白肋烟烟株农艺性状的影响 Table 1 Effect of burley tobacco and eggplant grafting on agronomic characters of burley tobacco

表2 白肋烟与茄子嫁接对鲜烟生物碱含量的影响 Table 2 Effect of burley tobacco and eggplant grafting on content of alkaloids in fresh burley tobacco leaves %

2.2.2 白肋烟与茄子嫁接对调制后烟叶生物碱含量的影响 由表3可知，白肋烟与茄子嫁接可有效降低调制后烟叶烟碱含量，其中烟茄嫁接后上部叶烟碱含量降低至0.120 1%，中部叶烟碱含量降低至0.088 0%。T3处理中、上部烟叶的烟碱、降烟碱、假木贼碱及总生物碱含量均显著低于T1和T2处理，其中T3上部叶烟碱、总生物碱含量较T1处理降低97.04%、96.74%，中部叶烟碱、总生物碱含量较T1处理降低97.59%、97.18%。表明烟茄嫁接能够大幅降低白肋烟叶片烟碱及总生物碱含量。

表3 白肋烟与茄子嫁接对调制后生物碱含量的影响 Table 3 Effect of burley tobacco and eggplant grafting on content of alkaloids in cured burley tobacco leaves %

2.3 白肋烟与茄子嫁接对白肋烟常规化学成分的影响

2.3.1 白肋烟与茄子嫁接对鲜烟叶常规化学成分的影响 对白肋烟鲜烟叶常规化学成分分析可知，白肋烟与茄子嫁接后叶片化学成分有显著变化(表4)，其中嫁接后60和90 d，T3处理的硝酸盐含量较T1分别降低30.00%和32.28%。嫁接后60 d，T2处理常规化学成分含量较T1无显著差异；T3处理还原糖、总氮含量均显著低于T1和T2处理，糖碱比值、氮碱比值大于T1和T2处理。嫁接后90 d，T2处理常规化学成分含量及糖碱比值、氮碱比值较T1均无显著差异；T3处理总氮含量显著低于T1以及T2处理，总糖、还原糖含量及糖碱比值、氮碱比值大于T1和T2处理。

表4 白肋烟与茄子嫁接对鲜烟叶常规化学成分的影响 Table 4 Effect of burley tobacco and eggplant grafting on chemical composition in fresh burley tobacco leaves

2.3.2 白肋烟与茄子嫁接对调制后烟叶常规化学成分的影响 对调制后烟叶常规化学成分分析可知，白肋烟烟叶常规化学成分受根系影响较大，白肋烟与茄子嫁接后叶片总糖、还原糖、淀粉含量升高，硝酸盐、总氮、蛋白质含量显著降低(表5)，其中T3处理上、中部叶硝酸盐含量较T1分别降低13.47%、13.39%。对上部叶，不同处理间总糖、还原糖含量无显著差异，T2处理硝酸盐、总氮、蛋白质和淀粉含量及糖碱比值、氮碱比值较T1差异不显著，T3处理淀粉含量及糖碱比值、氮碱比值显著高于T1和T2处理，硝酸盐、总氮、蛋白质含量显著低于T1和T2处理。对中部叶，T2处理常规化学成分含量及糖碱比值、氮碱比值较T1无显著差异，T3处理总糖、还原糖、淀粉含量及糖碱比值、氮碱比值均高于T1、T2处理，硝酸盐、总氮和蛋白质含量较T1、T2处理显著降低。

表5 白肋烟与茄子嫁接对调制后烟叶常规化学成分的影响 Table 5 Effect of burley tobacco and eggplant grafting on chemical composition in cured burley tobacco leaves

2.4 白肋烟与茄子嫁接对调制后烟叶TSNAS含量的影响

白肋烟与茄子嫁接后，调制后烟叶NNN、NAT、NAB、NNK及TSNAs含量均显著降低(表6)。对上部叶，T2处理的NNN、NAT、NAB、NNK以及TSNAs含量较T1无显著差异，T3处理的NNN、NAT、NAB、NNK以及TSNAs含量均显著低于T1和T2处理，其中T3处理NNN、NNK和TSNAs含量较T1分别降低76.02%、77.11%、75.68%。对中部叶，各处理NNN、NAT、NAB、NNK、TSNAs含量变化规律与上部叶一致，其中T3处理NNN、NNK和TSNAs含量较T1分别降低78.66%、83.92%、84.01%。结果表明，烟茄嫁接对白肋烟NNN、NAT、NAB、NNK以及TSNAs含量有显著影响。

表6 白肋烟与茄子嫁接对调制后烟叶TSNAs含量的影响 Table 6 Effect of burley tobacco and eggplant grafting on content of TSNAs in cured burley tobacco leaves μg·g-1

续表 Continuing table μg·g-1

2.5 白肋烟与茄子嫁接对调制后中部叶氨基酸含量的影响

不同处理17种氨基酸含量以及氨基酸总量测定结果见表7。与T1相比，T2处理氨基酸总量无显著差异，T3处理氨基酸总量增加；不同处理间谷氨酸、丝氨酸、丙氨酸含量存在显著差异，均表现为T3>T2>T1；不同处理的甘氨酸、精氨酸、苏氨酸、缬氨酸、蛋氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、赖氨酸变化规律一致，T2处理与T1相比差异不显著，但均与T3处理存在显著性差异，且均以T3处理含量最高；各处理组氨酸、酪氨酸、苯丙氨酸含量变化规律一致，表现为T3>T1>T2，其中T2处理较T1差异不显著，但均与T3处理存在显著差异，均以T3处理含量最高；T2处理半胱氨酸含量较T1无显著差异但显著高于T3处理；不同处理天冬氨酸、脯氨酸含量差异不显著。这表明嫁接处理能够改变白肋烟调制后烟叶氨基酸积累量。

2.6 白肋烟与茄子嫁接对烟叶感官质量的影响

由表8可知，烟茄嫁接对白肋烟对中、上部叶感官质量影响效果基本一致。与T1处理相比，T2处理烟叶感官质量无显著差异，但T3处理烟叶香气量、劲头、刺激性减小。结果表明，烟茄嫁接能够影响白肋烟烟叶感官品质，对劲头和刺激性有显著影响。

表7 白肋烟与茄子嫁接对调制后烟叶氨基酸含量的影响 Table 7 Effect of burley tobacco and eggplant grafting on content of amino acid in cured burley tobacco leaves g·kg-1

表8 白肋烟与茄子嫁接对调制后烟叶感官质量评价的影响 Table 8 Effect of burley tobacco and eggplant grafting on sensory quality in cured burley tobacco leaves

3 结论与讨论

烟碱主要在根部合成，然后通过木质部运输到地上部。通过烟茄嫁接的方法对白肋烟换根，能够显著降低叶片中的烟碱含量，且不会对烟株生长及形态建设产生较大影响。而接穗和砧木都为鄂烟1号时，旺长前期鲜烟叶烟碱含量较T1有所增加，猜测是由于嫁接时剪叶处理以及嫁接切口作为一种外源伤害能够诱导烟碱合成关键基因表达[26-27]，并且嫁接成活后烟苗根部能够继续合成烟碱并运输至地上部，从而导致其叶片烟碱含量高于T1处理，但随着烟株生长，外源伤害对烟叶造成的影响逐渐减小，叶片烟碱合成代谢过程趋于正常，成熟期及调制后T2处理烟叶烟碱积累量较T1无显著差异，或者是由于嫁接时损伤烟株，T1和T2处理烟株根系发育不同，具体影响机制还需要进一步研究。

研究表明，用氮高效的烤烟品种作砧木，能够提高嫁接苗氮代谢关键酶活性和氮代谢能力[28]，此外李耕等[21]研究表明，以烤烟为砧木能显著提高白肋烟接穗氮还原同化能力，且糖含量及蛋白质含量发生变化。因此，可能由于茄子与烟草氮代谢能力存在差异，导致烟茄嫁接后烟株氮素转运和碳氮分配发生改变，最终影响烟叶化学成分，因而嫁接后白肋烟糖含量升高，总氮、蛋白质含量及硝酸盐含量降低。而白肋烟与茄子嫁接后烟叶淀粉含量升高，可能是由于成熟后期叶片落黄较慢，采收时烟叶成熟度不足所导致，这与任梦娟等[29]在烤烟上的研究结果一致。此外，烟草体内游离氨基酸是合成蛋白质的基本单位，也是蛋白质降解的产物，同时也是合成烟碱、多酚等的原料，它参与烟株的氮、碳代谢，影响烟株内含氮化合物及其他化学成分物质的形成[30-31]。因此，烟茄嫁接后烟叶游离氨基酸含量增加可能是烟茄嫁接后烟碱合成减少或蛋白质合成、降解发生改变，进而使氨基酸在烟株体内积累，其具体影响机制还需要进一步研究。

本试验中烟茄嫁接后白肋烟NNN、NNK、TSNAs含量降低。烟草特有亚硝胺(TSNAs)是烟草生物碱与含氮氧化合物经过硝化反应后生成的，研究表明，TSNAs与降烟碱、新烟草碱含量以及总生物碱含量呈显著正相关关系，NNN与降烟碱呈极显著正相关关系[32]，而NNK含量与烟碱含量呈极显著正相关关系[33]。烟茄嫁接后，白肋烟烟碱、降烟碱以及总生物碱含量降低幅度较大，且烟叶中未检测出新烟草碱，这可能是嫁接后白肋烟TSNAs含量降低的重要原因。

烟碱和总氮含量直接影响烟叶的生理强度，同时也对烟叶感官质量有重要影响。白肋烟氮碱比与香气量及白肋烟风格程度紧密相关，一般认为随着总氮和烟碱含量升高，烟叶香气量增加，此外有学者认为，氮碱比值以1∶1较为适合，若比值过大，烟气香味会逐渐减少[34]。本研究中，烟茄嫁接后白肋烟烟叶香气量、劲头、刺激性减小。这可能与烟碱含量大幅降低、氮碱比增大紧密相关。

白肋烟与茄子嫁接后，烟株农艺性状未显著改变，烟叶常规化学成分有显著变化，主要表现在叶片烟碱含量大幅降低，氨基酸总量增加，NNN、NNK以及TSNAs含量显著降低。同时，烟茄嫁接后白肋烟烟叶香气量减少，劲头、刺激性明显减小。本研究为通过农业措施大幅降低白肋烟烟碱含量提供了技术支持。