纳米疫苗在防控非洲猪瘟中的应用前景

王亚楠， 霍健， 黄冉， 程航航， 范道朋， 王淑琪， 何华， 张改平

(河南农业大学动物医学院 国家动物免疫学国际联合研究中心，河南 郑州 450046)

非洲猪瘟(African swine fever, ASF)是由非洲猪瘟病毒(African swine fever virus, AFSV)感染野猪和家猪引起的急性并带有出血性的传染性疾病。被感染的猪主要出现发热、心跳加速和呼吸不畅等症状，其中部分被感染猪的眼和鼻内出现浆液性分泌物，皮肤发绀，肾脏和淋巴结明显出血[1-3]。ASFV为非洲猪瘟病毒科(Asfarviridae)非洲猪瘟病毒属(Asfivirus)的唯一成员，而且是目前已知的唯一虫媒DNA病毒[4]。ASFV宿主包括家猪、非洲疣猪和丛林猪，同时还包括无脊椎节肢动物软蜱[5]。ASFV具有高死亡率和传染性，这导致ASF一旦发生就会造成养殖场的猪成规模死亡，对养猪业造成严重的经济效益损失[6]。与自然宿主非洲疣猪感染ASFV基本无症状相比，家猪和野猪在感染该病毒后大多会出现严重临床表现，甚至会在感染后7～10 d内死亡[7]。目前，ASF已经在全球范围内引起高度重视，中国也将ASF列为一类动物疾病[8]。2018年8月，ASF首次传入中国并广泛传播，导致中国生猪产量大幅下降。截至2021年5月，ASF在中国已发生191起，累计扑杀生猪约121.01万头，严重影响中国养猪行业的发展[6]。

目前，严格的生物安全措施(消毒、隔离和扑杀等)是防控ASF的主要方式。但是，受养殖人员生物安全意识薄弱和大量野猪存在等因素的影响，利用生物安全措施防控ASF效果有限，新的疫情仍在不断发生[9-11]。另外，其他治疗措施包括向病猪施用恩诺沙星以及月桂酸单甘油酯等被证实对ASF无效[12]。疫苗接种是通过加强动物自身免疫力进而达到对动物传染性疫病预防、管理、控制、净化及消灭等目的的重要手段。疫苗在制备过程本身保留了病原刺激动物体免疫系统的特性。当动物体内接触到这种不具伤害力的病原后，机体自身的免疫系统便会产生一定的保护物质，例如免疫激素、活性生理物质和特异性抗体等。当再次被病原侵袭时，动物体的免疫系统便会发挥特异性功能，依循其原有的记忆制造更多的保护性抗体阻止病原的伤害。由于现阶段没有ASF特异性治疗药物，因此，疫苗接种被认为是防控ASF最有效的手段。但是，疫苗接种的安全性和保护性仍是其亟待解决的问题。纳米疫苗是基于纳米材料与纳米技术制备出来的新型疫苗，具有增强疫苗免疫激活能力、提高稳定性以及降低毒性等优势，因而被广泛用于疫苗递送系统，但是目前少见关于ASF纳米疫苗的研究报道。本综述针对ASF疫苗的研制现状进行论述，探讨新型纳米疫苗在畜牧兽医领域的应用以及在防控ASF中的展望，以期为ASF疫苗的研发提供新的方向。

1 ASF疫苗研究现状

1921年ASF首次在非洲肯尼亚发现，并在撒哈拉以南的非洲国家扩散；1957年后相继扩散到西欧和拉美等地区。ASFV表现出存活时间长、抵抗力强、基因组强大及易变异等特点，使其疫苗研发工作十分困难。早期ASF疫苗研究主要停留在灭活疫苗的研制上，到20世纪70年代随着基因工程技术的迅速发展，基因工程疫苗逐渐成为主流。

1.1 灭活疫苗

灭活疫苗是利用β-丙内酯、福尔马林处理及加热等方式将病原灭活，在病原丧失毒性及传染性的前提下保持其免疫原性的常规疫苗。灭活疫苗具有制备方法简单、价格低等优势。灭活疫苗是猪细小病毒病、猪链球菌病、高致病性猪蓝耳病和猪肺疫等传染性疾病治疗初期首选的疫苗制剂[13]。ASF疫苗在初期也曾尝试利用这类经典的疫苗制备方式，虽然疫苗效价活性在一定程度上有所增强，但最终都未能起到有效的细胞免疫保护效果[14]。BLOME等[15]将灭活的ASF疫苗与最新型佐剂Emulsigen®-D联合使用，在对猪免疫之后进行攻毒试验，结果发现猪的血液中能够检测到该病毒的特异性抗体，但在机体内无法发挥免疫保护作用，推测可能与ASFV在宿主细胞内外具有不同的病毒生物学的特性相关。成熟的ASFV病毒粒子在不同成熟方式中具有巨大的免疫原性差异。ASFV病毒粒子成熟包括细胞内成熟和细胞外成熟。细胞内成熟是指在被感染细胞的病毒工厂中组装，最终形成含有病毒基因组、核心壳层、双层脂膜和衣壳结构的ASFV病毒粒子，包含50多种蛋白。细胞外成熟是指在病毒工厂中组装后以出芽的方式获得囊膜并释放至细胞外，形成包含CD2V、p12等病毒蛋白和部分细胞蛋白的ASF病毒粒子[16]。这两者表面蛋白种类数量差异较大。成熟的ASF病毒粒子表面蛋白在宿主细胞内外的不同结构区域有着巨大的差异，这种差异导致这2种类型的病毒的免疫原性不同，推测是诱导免疫原性改变和影响灭活疫苗的效果因素之一[17]。因此，灭活疫苗无法有效防控ASF。

1.2 弱毒疫苗

弱毒疫苗是通过人工将ASFV在细胞内(包括猪骨髓来源细胞、Vero细胞和COS-1细胞等)中断传代以降低病毒毒力的病原性疫苗[18]，其病原致病性相对较弱但仍具有免疫原性。MONTEAGUDO等[19]研究表明，ASF的BA71毒株在缺失CD2v基因后毒力水平明显减弱；在此基础上制备的基因缺失弱毒疫苗不仅对同源强毒株具有抵抗力，而且对不同基因型毒株也具有交叉保护作用。弱毒疫苗在临床上表现出免疫原性好、同源包含率高的特点，但存在毒力返强的可能性[20]。GAUDREAULT等[21]研究表明，基因重组的NH/P68弱毒疫苗能够有效促进猪体内细胞毒性T细胞与NK细胞的活性，并且能够有效抵御强毒株的攻击。但是，在整个免疫反应过程中，该弱毒疫苗也产生了不同程度的副作用，例如行动障碍、病毒血症、肺炎及流产等症状。同时，随着时间的延长，猪体内的CD8+T细胞不断消耗，该弱毒疫苗的免疫效果逐渐减退，对病毒出现不完全保护[22-24]。目前，这些已经研发的基因缺失ASF弱毒疫苗仍处于试验性阶段，其安全性仍然存在巨大挑战。

1.3 基因工程疫苗

基因工程疫苗是利用生物技术将保护性抗原的基因片段克隆到表达载体，进而在体外表达并纯化重组蛋白的疫苗。该类疫苗克服了传统弱毒疫苗毒力返强以及灭活疫苗灭活不完全时的安全性问题，是目前尚不能培养或繁殖有困难的病毒相关疫苗研发的重要途经[25-26]。目前，ASF的基因工程疫苗研究主要有亚单位基因工程疫苗、DNA疫苗和病毒活载体疫苗。其中，相关研究主要集中在p30、p54、p72、CD2v、EP153R、p12、D117L和pp62等蛋白上，这些蛋白被认为具有免疫原性，能够用于构建亚单位疫苗。但是，该类疫苗的安全性问题仍有待验证。杨思成等[27]研究表明，用p30或p54蛋白免疫的家猪虽然能够诱导机体产生中和ASFV的抗体，但存在免疫后家猪被感染死亡的风险。研究人员利用重组杆状病毒同时表达p30和p54蛋白所制备的亚单位疫苗，在使用中发现不仅不能抵抗ASFV体内攻击[28]，而且可能导致猪出现病毒血症等疾病[29]。WU等[30]研究表明，利用杆状病毒表达CD2v蛋白，并用弗氏佐剂接种猪之后，猪对同源ASFV E75毒株的攻击具有剂量依赖的保护作用，但不具有中和抗体的作用。GALLARDO等[31]研究表明，缺乏A238L基因的重组NH/P68毒株对同源强毒株L60表现出理想的保护效果，但接种疫苗的猪中有一部分出现病毒血症和其他副作用。因此，基因缺失疫苗虽然取得了一些成功，但仍有不确定性。

传统方式制备的疫苗存在免疫原性不强、安全性差等问题[32]。其中，ASF灭活疫苗或亚单位疫苗难以诱导中和抗体，不能为机体提供有效免疫保护效率；而弱毒疫苗只在理论上存有可行性，在体外试验中只能在猪的原代巨噬细胞中增殖，难以通过传代致弱的途径获得安全并且有效的弱毒疫苗[33]。因此，寻求一种新型的疫苗形式用于防控ASF并增强体内免疫反应就很有必要。

2 纳米疫苗防控ASF的潜力

2.1 纳米疫苗的概况

纳米技术是具有广阔应用前景的技术。纳米技术与免疫学融合的新型产物已经成为当前疫苗研究开发的热点[34]。纳米疫苗(nanovaccine，NVs)是以纳米材料作为载体或免疫调节剂，通过化学或物理方式连接抗原和佐剂制备出的用于疾病预防和治疗的疫苗[35]。纳米颗粒由天然高分子物质或合成高分子物质包括聚乳酸-羟基乙酸共聚物(ploy(D,L-lactic-coglycolic acid), PLGA)、聚乙二醇(polyethylene glycol，PEG)以及壳聚糖(chitosan, CS)等构成，制备材料来源广泛，具有优异的生物相容性和生物可降解性，广泛应用于生物和医学领域[36]。大多数纳米材料具有激活体内免疫效果的能力，但仍有少数纳米材料不足以刺激机体固有的免疫反应。因此，为实现高效、特异性多重激活细胞免疫和体液免疫，在制备纳米疫苗的过程中需要在纳米材料中添加特异性抗原，并通过包埋、吸附和化学键合等方式将抗原与粒子紧密结合，最终递送到动物体内发挥效用[37]。表面吸附通常是非共价键作用，这会导致抗原从纳米颗粒中快速解离。因此，将抗原与纳米载体通过化学键或包封的方式连接在一起，能够使二者之间更加稳定[38]。由于通过简单的混合反应就能将抗原有效封装至纳米载体中，且在纳米载体部分解离后该纳米颗粒才能释放抗原，这使得抗原可以在体内缓慢释放。纳米疫苗具有延长体内循环时间、增强抗原稳定性、生物相容性好、安全性高、抗原储存效果强、提高抗原摄取和减少免疫次数等优势，已被广泛应用于畜牧兽医领域。

2.2 纳米疫苗在兽用疫苗中的应用

纳米技术的发展为兽用疫苗提供了新的研究方向与思路，但是目前还未有针对ASF纳米疫苗的研究报道。本综述介绍目前在兽用疫苗中纳米疫苗的种类，以期为ASF纳米疫苗的研究提供参考。

2.2.1 聚乳酸-羟基乙酸共聚物 聚乳酸-羟基乙酸共聚物(ploy(D,L-lactic-coglycolic acid)，PLGA)是由2种单体(乳酸和羟基乙酸)聚合而成的可降解的功能高分子有机化合物。PLGA因其具有良好的生物相容性、无毒性及释放缓慢而被广泛用于制药和医用材料。由于 PLGA的降解产物是乳酸和羟基乙酸，同时乳酸又是体内的正常代谢产物，因此不会产生毒副作用。为了增强猪圆环病毒2型(porcine circovirus 2，PCV2)抗原特异性淋巴细胞增殖，增强外周血单核细胞中T细胞的免疫效率，WANG等[39]以PCV2 Cap蛋白亲和肽为基础与PLGA共价偶联，得到含有PCV2 Cap抗原的PLGA纳米颗粒(PLGA-Cap NPs)。PLGA-Cap NPs能够更好地被抗原呈递细胞(antigen-presenting cells, APC)识别并吞噬，其引起的免疫反应作用强，在RAW264.7细胞中IL-1β、IL-12和TNF-α的分泌水平高于游离蛋白组，并且可以特异性富集PCV2 Cap，增强APC对抗原的靶向性，促进APC的摄取。WANG等[39]还将不同拷贝数的甲型流感病毒保守肽M2e插入到PCV2 Cap蛋白中，构建了对甲型流感病毒和PCV2具有双重保护作用纳米疫苗。

2.2.2 金纳米粒 金纳米粒(AuNPs)是非常适合应用在生物医学领域的新型材料。AuNPs粒径通常为10～20 nm，一般以金溶胶使用，也称胶体金。AuNPs是具有稳定性高、毒性低、生物相容性良好及与生物分子选择性结合的能力[40]。SINGH等[41]研究表明，AuNPs在提高疫苗效力方面具有巨大潜力，包括诱导巨噬细胞激活、刺激淋巴细胞反应及针对某些抗原产生抗体，已经成为增强免疫应答的良好载体。STAROVEROV等[42]使用球形AuNPs作为猪传染性胃肠炎病毒(swine transmissible gastroenteritis virus，TGEV)抗原的载体。AuNPs偶联TGEV抗原的纳米疫苗对动物进行免疫接种，能够激活APC，还能增加脾淋巴细胞的增殖活性。免疫后动物体内的IFN-γ、IL-1β和IL-6的含量高于免疫前或直接免疫接种抗原的动物；AuNPs-TGEV免疫动物后巨噬细胞和B细胞的活性都有了明显的提升，并且提高了体内细胞免疫的效果。此外，AuNPs-TGEV可以显著改善动物免疫器官的结构，并恢复这些器官的形态功能状态。

2.2.3 聚酸酐纳米颗粒 聚酸酐(polyanhydrides)新型合成生物可降解的高分子材料，由1,8-双(对羧基苯氧基)-3,6-二氧辛烷(CPTEG)和1,6-双(对羧基苯氧基)己烷(CPH)组成的共聚物纳米颗粒，已被证明可以增强流感病毒抗原的稳定性和持续释放[43]。DHAKAL等[44]开发了聚酸酐纳米颗粒为基础的猪流感疫苗，共包埋灭活可溶性抗原(KAg)和Toll样受体(TLR-9)激动剂(CpG-ODN)，并将该纳米疫苗与含5倍以上抗原的KAg疫苗在异源病毒攻毒后的免疫原性和保护效果进行了比较；结果表明，与鼻内递送可溶性KAg疫苗相比，该纳米疫苗显著降低了流感引起的发热现象，并且提供了更好的保护效果，鼻病毒脱落量减少93.75%，肺部病毒滴度降低98.75%。聚酸酐纳米疫苗可诱导猪产生较高的黏膜抗体和细胞免疫应答，提供更好免疫保护效力。

2.2.4 壳聚糖 壳聚糖(chitosan, CS)是自然界中唯一存在的碱性多糖[45]，为氨基葡萄糖与N-乙酰葡萄胺的共聚物。在酸性条件下，壳聚糖被质子化后可溶于水并且带正电荷。带负电荷的抗原与带正电荷的CS可通过表面静电作用发生生物黏附，进而形成NVs并有效进入细胞。CS分子中的羟基、氨基可与黏膜中带负电荷的糖蛋白结合而产生黏膜吸附作用，当抗原进入消化道内避免被快速清除，延长其与黏膜接触时间，提高免疫应答。RENU等[46]制备了以壳聚糖为载体包埋甲型猪流感病毒抗原(KAg)的纳米疫苗。为了将候选疫苗有效靶向于表达甘露糖受体的树突状细胞和巨噬细胞，该研究将甘露糖与壳聚糖偶联，并制备了甘露糖化壳聚糖(mCS)纳米粒包裹KAg纳米疫苗(mCS NPs-KAg)。以母源抗体(maternal antibody，MDA)阳性猪为试验对象，mCS NPs-KAg纳米疫苗的接种后提高了呼吸道中同源、异源和异亚型病毒特异性黏膜的sIgA和IgG与全身的IgG的表达，增加了气管支气管淋巴结特异性Recall细胞增殖和细胞因子基因表达，从而减少/清除了异源攻击病毒感染。因此，mCS NPs-KAg纳米疫苗可以有效替代商品化流感疫苗。

2.3 纳米疫苗防控ASF免疫学优势

2.3.1 提高抗原递送效率 纳米粒(nanoparticles，NPs)是由高分子材料形成的载体颗粒，用于包载药物、基因以及抗原等，可以递送抗原、增强抗原免疫原性并防止抗原提前降解。小尺寸的纳米颗粒在体内具有更好的渗透性，更容易通过体内生物屏障，将抗原更加有效地递送至靶标部位[47]。从免疫学角度分析，NPs粒径分布较为集中，当进入机体时，巨噬细胞和树突状细胞优先识别、吞噬被纳米系统递送的抗原，为诱导机体产生有效的免疫效率提供保障。REDDY等[48]研究表明，小分子聚合物NPs可有效富集在淋巴结处并且至少停留120 h。此外，小尺寸NPs能够充当免疫佐剂的作用，将抗原有效递送至APC，以提高ASF抗原的免疫应答[49]。该类小尺寸NPs主要通过吞噬作用进行摄取，并经MHC-Ⅱ类途径和MHC-Ⅰ类途径同时提呈[50]，共同诱导体内T细胞和B细胞的成熟，协同增强免疫效率。这类纳米载体粒径小且均一，通常在200 nm以下，因此作为ASF抗原的递送系统更容易通过淋巴管引流至淋巴结中，从而进一步促进ASF抗原在体内的吸收，增强ASF抗原在淋巴结的聚集，有利于淋巴结中APC的摄取和成熟[51]。

2.3.2 靶向增加抗原摄取 为了提高体内抗原摄取量，可在NPs表面进行靶标分子修饰，以确保高效递送抗原至树突状细胞(dendritic cells, DC)及其他相关免疫细胞，并诱导细胞免疫和体液免疫，提高原有疫苗的免疫原性[52]。利用靶向配体与机体某些组织或是细胞之间进行特异性结合，促使NPs在特定部位聚集从而实现高效免疫[53]。因此，在NPs表面修饰与DC表面受体结合的配体，如甘露糖 (mannose，MR)、透明质酸 (hyaluronic acid，HA)等，可以对DC进行精准靶向，提高DC对ASF抗原的摄取效率。CHAUBEY等[54]研究表明，通过MR修饰的NPs能够主动靶向体内的APC，从而增强免疫反应。当DC与包载抗原的脂质体共孵育时，脂质体能够提高CD80、CD86等细胞共刺激因子的表达水平。CD44受体在DC表面高度表达，CD44和HA的结合可以触发CD44胞质结构域和信号转导因子结合。因此，HA常用于修饰NPs，实现抗原的靶向递送。LIANG等[55]研究表明，利用HA修饰的NPs包载模式抗原-卵清蛋白(ovalbumin，OVA)，不仅实现了OVA到DC的靶向递送，且具有靶向作用的NPs的细胞摄取量是游离OVA的10倍。因此，利用特定的抗体或配体对纳米颗粒进行表面修饰能够增加其在体内分布和组织摄取效率和免疫治疗水平[56]。这类纳米载体通过对纳米载体表面进行靶标修饰，使包封ASF抗原的纳米载体高度聚集在特定APC部位，从而实现ASF抗原的精准靶向递送，增强免疫效应。

2.3.3 表面电荷增强免疫反应 体外研究表明，NPs表面电荷对APC的吞噬作用有重要影响[38]。细胞对ASF抗原摄取速率以及摄取量均与NPs表面电荷呈正相关。由于细胞膜带负电，因此阳离子NPs更容易被APC吸引，从而促使NPs呈递到淋巴结中[57]，比中性或是负电荷NPs更容易被吞噬。FROMEN等[58]研究表明，具有高表面电荷的NPs更容易被巨噬细胞吞噬。带正电荷的NPs被细胞内化后能在核周定位，经给药后能引起较强的体液免疫和黏膜免疫，提高抗原包封率，增强免疫效果，而带负电荷的NPs没有此免疫反应[59]。因此，不同电荷的纳米载体对细胞内化效率不同，利用正电荷的纳米载体包封ASF抗原能够显著提升细胞的内化效率，提高抗原免疫效应。

2.3.4 增强T细胞免疫效率 传统的ASF疫苗不能有效诱导机体产生细胞毒性T细胞(cytotoxic T lymphocyte, CTL),无法刺激机体产生有效的细胞免疫。MESHULAM等[60]研究表明，在去除弱毒免疫猪体内的CD8+T淋巴细胞后，免疫猪不能抵御ASFV强毒的攻击。细胞免疫尤其是CD8+T淋巴细胞在抗ASFV感染中起到了至关重要的作用[61]。因此，激活机体的细胞免疫的能力，尤其是激活CD8+T淋巴细胞在ASFV感染的免疫保护应答中的作用[62-63]，是研发安全有效的ASF疫苗的关键[64]。刘晓璇[65]研究表明，外源性蛋白/多肽在一些阳离子材料如聚乙烯亚胺(polyethylenimine, PEI)、羟基氯喹(hydroxychloroquine, HCQ)的辅助下，易从溶酶体逃逸至细胞质中实现抗原的交叉呈递，使外源性抗原能与APC表面的MHC-Ⅰ类分子相结合，APC加工提呈给T淋巴细胞并激活初始CD8+T淋巴细胞，促进CD8+T淋巴细胞转化为CTL，实现高效、特异性多重激活细胞免疫和体液免疫，最终通过杀灭被ASFV感染细胞实现阻断ASFV的胞内复制[66]。

2.3.5 降低全身毒副作用 传统疫苗ASF疫苗的副作用较大，将大大影响该疫苗的有效研发，利用纳米生物材料能够参与免疫过程的免疫佐剂的转运，可以将免疫抗原与佐剂安全有效富集在特定的细胞或是组织上，包括TLRs激动剂和细胞因子等，从而有利于协同ASF抗原发挥免疫效率[67]。该类抗原通过纳米载体的转运，最大程度地减少抗原或佐剂的全身传播和分布，降低毒副作用[68]。

3 展望

ASF是由ASFV引起的急性动物传染病，是危害全世界养猪业的头号杀手，给全世界养猪业带来了沉重的打击[69]。从长远角度来看，高效、安全的疫苗已经成为防御ASF的重要方式。在病毒感染的预防中，疫苗是防控传染性疾病发生的重要措施，生产和使用安全有效的疫苗至关重要。目前，ASF疫苗存在诱导抗体水平低、安全性差等问题，达不到有效预防ASF的目的，导致有效的商业化疫苗还未出现。因此，寻求新的疫苗策略增强机体免疫反应十分迫切。纳米疫苗以其提高抗原生物利用度、靶向递送抗原至APC、抗原交叉呈递以及增强T细胞免疫反应等特点被广泛运用到疫苗领域。纳米载体通过与多种ASF抗原的结合，能够准确递送至相对应的细胞部位并引起体内强烈的免疫效应，从而平衡疫苗安全性和免疫原性之间的冲突。纳米载体作为新型生物疫苗技术必将在预防传染性疾病中发挥重要的作用，并为防控ASF提供了新的手段。将纳米疫苗应用在防控ASF上，不仅能丰富ASF疫苗的种类，还能加快ASF疫苗的研究进度，进而促进中国乃至世界养猪业的健康发展。