肠道菌群丰度和多样性对肝纤维化的加速或延缓作用及特殊菌群的防治研究进展

郑博文，王佳慧，罗淑娟，赵铁建，郭新华，郑 洋

（广西中医药大学1.基础医学院生理教研室，2.赛恩斯新医药学院医学系，广西 南宁 530222）

肝纤维化是许多肝病的初级发展阶段，若未及时进行干预治疗，则会进一步恶化最终发展为肝硬化。肠道菌群作为人体最大的微生物群通过影响肝炎症反应对肝纤维化病理过程的进展发挥加速或延缓作用[1]。因此，本文基于“肠-肝轴”理论，以在肝纤维化进程中发生明显丰度改变的普氏粪杆菌（Faecalibacterium prausnitzii）、乳酸杆菌（Lactobacillus）、雷氏普鲁威登斯菌（Providencia rettgeri）和大肠杆菌（Escherichia coil）为切入点，根据各自的生理功能总结其在肝纤维化进程中发挥的具体作用；另外，在肝纤维化炎症反应及肝星状细胞激活中发挥信号转导作用的Toll样受体4（Toll-like receptor 4，TLR4）和TLR9所介导的信号通路为例，对肠道菌群通过激活信号通路在加速或延缓肝纤维化进程中的作用进行了综述。此外，本文以在肝纤维化进程中发生明显丰度改变的菌群及TLR4和TLR9分子为出发点，提出了一些肝纤维化的辅助诊治设想，以期为肝纤维化的临床诊断与治疗提供一个新的方向与思路。

1 肝纤维化进程中的关键因素

肝纤维化是各种慢性疾病长期对肝进行作用而引起的病理性修复反应，在这个修复过程中会产生大量纤维结缔组织，纤维结缔组织不断沉积，最终导致肝纤维化的发生[2]。肝纤维化若未得到有效治疗则会发展成肝硬化、肝细胞肝癌（hepatocellular cancer，HCC）和肝衰竭，死亡率升高[3]。

1.1 肝星状细胞活化

肝纤维化发生的特征性表现是细胞外基质（extracellular matrix，ECM）大量沉积，而活化的肝星状细胞（hepatic stellate cell，HSC）是ECM的主要来源[4]。HSC可以通过促进细胞因子和趋化因子的分泌以及与免疫细胞发生作用来激活免疫应答反应[5]，而细胞因子及免疫应答反应产物会促进HSC活化。活化的HSC会进一步转变为肌成纤维细胞（myofibroblast，MFB），进而分泌大量的转化生长因子、α平滑肌肌动蛋白和Ⅰ型胶原蛋白[6]，进而表现为ECM大量沉积，促进肝纤维化的发生发展。

肝慢性炎症可通过多种方式激活HSC导致肝纤维化的发生。例如，枯否细胞的脂质过氧化会导致其周围的HSC发生活化[7]；枯否细胞和肝细胞能释放活性氧（reactive oxygen species，ROS），增加肝细胞的氧化应激反应，进一步刺激HSC发生活化[8]；细胞因子如转化生长因子 β（transforming growth factor-β，TGF-β）作用于HSC导致其发生活化[4]。

1.2 免疫反应

免疫反应在肝纤维化发生之前就已经产生，由免疫反应产生的产物（如炎症因子和ROS）会激活HSC。活化的HSC会通过分泌炎性细胞因子与免疫细胞相互作用，调控适应性免疫应答[9]。如此循环，活化的HSC与免疫细胞之间不断刺激，导致肝纤维化的进一步发展。

免疫细胞中的枯否细胞、自然杀伤细胞（natural killer cell，NK）、辅助性 T 细胞 2（T helper 2 cell，Th2）和单核细胞等在肝纤维化进程中发挥不同的作用。枯否细胞激活导致NF-κB活性升高，从而释放促炎因子和趋化因子[10]，进而激活HSC。NK细胞主要通过抑制或杀死活化的HSC发挥抗纤维化作用[11]。Th2细胞可促进肝纤维化的产生，可通过白细胞介素4（interleukin 4，IL-4）和IL-13，加快肝纤维化的进展[12]。另外，CD14＋促炎单核细胞会转化为成纤维细胞加速肝纤维化的发展[13]。

研究发现，肝纤维化是一个可逆的过程，可通过发病因素、促进活化的HSC转变为静息态等方式达到延缓和治疗肝纤维化的目的[12]。

2 肠道菌群丰度与肝纤维化的关系

肠道菌群包括1000多种细菌[14-16]，依据丰度占比可分为优势菌群和次要菌群。正常状态下，两者处于动态平衡，共同参与人体的各项生理活动。成人肠道的优势菌群主要是拟杆菌门（Bacteroidetes）和厚壁菌门（Firmicutes），其次是放线菌（Actinomycetes）[17-18]；次要菌群则以需氧菌为主，其存在高流动性表现并具备潜在致病性。当优势菌群与次要菌群的细菌丰度、占比、种类和存活部位及一项或几项生理活动发生改变时，可导致肠道菌群失调，进而引发一系列的生理病理现象。

临床试验发现，进展期肝纤维化患者肠道大肠杆菌和变形杆菌（Proteus）丰度提高，而厚壁菌门丰度下降[21]。有研究者通过肠道菌群宏基因测序发现[17]，非酒精性脂肪性肝炎（nonalcoholic steatohepatitis，NASH）患者肠道的类杆菌丰度和厚壁菌丰度较健康人群有明显提高。丙肝患者存在由肠杆菌（Enterobacte）、梭菌（Clostridium）ⅩⅣ和毛螺菌（Lachnospira）等组成的特殊肠道菌群结构[20]。NASH患者拟杆菌门和普雷沃菌属（Prevotella）和斑单胞菌属（Pseudomonas）比例较高[17]。NASH患者的肠道微生物群以厚壁菌门和拟杆菌门为主，其次是变形菌和放线菌门，后者丰度明显较低[19]。由上述可知，当肝纤维化发生时，肠道菌群的组成及其丰度会随之发生明显改变。

肝75%的血液来自门静脉，门静脉将肠道和肝紧密的联系在一起[22]，使得肝与肠道菌群之间拥有双向作用[23-24]，这种双向作用依赖于胆道系统和循环介质[25]。肝产生的一些炎症介质可能导致肠道上皮黏膜免疫功能改变和屏障功能障碍[26]，导致肠道菌群的组成发生变化，进而反作用于肝，使其发生病变。例如，脂多糖是革兰阴性菌外膜的中心成分[21]，可作为免疫反应激活物促进机体的炎性反应。即革兰阴性菌丰度的增加会导致肝纤维化的发生。

综上所述，不同慢性肝病的患者均会发生肠道菌群失调，而肠道菌群失调又会反作用于肝，进而促进肝纤维化的发生与发展。因此对肠道菌群进行干预有望成为预防和治疗肝纤维化有效方法。

3 肠道菌群通过自身丰度改变及介导炎症反应对肝纤维化的作用机制

近年来，“肠-肝轴”这一概念被越来越多人认可并提及，而这一概念的提出是基于正常人体中的2道防线，即肠道屏障和肝提供的屏障。完整的肠道屏障是肠道菌群与肝进行正常的相互作用所必需的，它是一种机械、生物、免疫和化学屏障，是人体与外源性物质接触的第一道防线[27]；肝内含有大量的免疫细胞，对于逃逸胃肠黏膜免疫监视的抗原和炎症因子，则由肝将其清除。

“肠-肝轴”理论认为：一方面，当肠屏障功能受损后，肠道通透性增加，肠源性细菌抗原如肠道内的细菌和内毒素等会大量涌入门静脉并由此进入肝；另一方面，肝内的巨噬细胞（枯否细胞）会被脂多糖（内毒素）激活，进而释放大量炎症因子，各类细胞因子与炎症介质之间相互关联，进一步造成肠道黏膜及远隔器官的损伤[28]。另外，肠道微生物群可以通过影响营养物质的消化和吸收，进而改变胆汁酸浓度影响脂肪酶活性，调节肝脂肪变性、炎症和纤维化过程[3]。基于此，下文从特殊菌群和及其介导的炎症反应方面论述肠道菌群对肝纤维化的促进或延缓作用。

3.1 特殊菌群对肝纤维化促进或者逆转的双重作用

众多实验数据表明[11-12]，当发生肝纤维化时，一些特殊菌群会出现明显的丰度变化，通过研究特殊菌群的生理作用可揭示其在肝纤维化发生发展中的作用。

3.1.1 普氏粪杆菌

有研究表明，严重酒精性肝炎患者的肠道普氏粪杆菌相对缺乏，而这种细菌具有抗炎和保护黏膜的特性，其抗炎作用的部分原因是分泌的代谢物阻断NF-κB活化和IL-8分泌[29]。在肠道中，肠道菌群通过消化碳水化合物产生短链脂肪酸（short-chain fatty acid，SCFA），如乙酸盐、丙酸盐和丁酸盐等，并将这些脂肪酸作为肠上皮细胞的能量来源，这个过程是维持肠壁屏障完整性所必需的[30-31]。其中，丁酸盐通过调节紧密连接蛋白和黏蛋白的表达有助于维持肠道屏障的完整性，而产生丁酸盐的肠道菌种之一便是普氏粪杆菌。因此，普氏粪杆菌可通过保护黏膜来阻止细菌及其代谢产物由门静脉进入肝。

综上可知，普氏杆菌可以从抗炎和保护肠屏障功能两个方面延缓肝纤维化的进展。

3.1.2 乳酸菌

慢性肝病肠道微生物群显示出变形杆菌和梭杆菌属增加，拟杆菌属和乳杆菌属种类减少的现象[32]。肝硬化时，拉氏菌科（Lachnospiraceae）和乳杆菌科减少，而肠杆菌科、产碱杆菌科和梭杆菌科显著增加[33]。已知乳酸菌有助于产生细菌素，如抗生素可抑制肠杆菌科的病原体，如沙门菌（Salmonella）或志贺菌（Shigella），且乳酸菌的过氧化物酶系统对其他细菌具有抑制作用[34-35]，进而可以减少由肠道进入肝的细菌，减缓肝纤维化的进程。另外，乳酸菌通过黏附在肠上皮细胞上，保护肠上皮细胞免受病原性和侵袭性细菌的侵害[36-37]，且它们的发酵产物包括SCFA，如乳酸、丙酸或丁酸，作为营养提供给上皮细胞，进而保护肠道屏障功能[38]。

综上可知，乳酸菌可通过抑制有害细菌的生成和保护肠道屏障功能减缓肝纤维化。

3.1.3 雷氏普鲁威登斯菌

胆碱是一种必需营养素，对肝功能、大脑发育、神经功能、肌肉运动和维持健康代谢非常重要[39]。人体可将胆碱加工成磷脂酰胆碱（卵磷脂），有助于从肝排出极低密度脂蛋白（very low density lipoprotein，VLDL）颗粒，防止甘油三酯在肝积聚（肝脂肪变性），进而防止肝损伤以及非酒精性脂肪肝和肝肿瘤的发生。此外，一些肠道细菌可以将胆碱转化为三甲胺（trimethlamine，TMA），通过门静脉循环转移到肝，进而转化为三甲胺N-氧化物（trimethylamineN-oxide，TMAO）[40]。随着 TMAO 的体循环的增加，机体产生磷脂酰胆碱的水平降低，甘油三酯在肝内大量聚积导致肝损伤，进而引起肝纤维化的发生。因此，TMA的产生与肝纤维化密切相关，而雷氏普鲁威登斯菌则是胆碱消耗和TMA产量最高的菌群之一[41]，所以雷氏普鲁威登斯菌可以通过大量产生TMA导致肝纤维化并加速其发展进程。

3.1.4 大肠杆菌

在厌氧条件下，大肠杆菌进行混合酸发酵，其主要产物是乙醇[15]。由基于儿童NASH患者的研究结果推测，结肠微生物群的代谢产物可能是NASH患者血液酒精浓度升高的主要原因[42]，并提出NASH发病的一种新机制：富含产酒精细菌（如大肠杆菌）的肠道微生物群持续产生比健康微生物群更多的酒精，酒精的诱变作用可导致ROS的生成增加[45]，进而导致肝炎的发生。

另外，非酒精性肝病和酒精性肝病都表现出乙醇及其代谢物乙醛和乙酸水平的增加[43]。其中，乙醛与削弱肠道紧密连接、破坏肠道屏障有关[44-45]，也与肠道中抗菌肽的表达下调有关[46-47]。通过乙醛对肠道的作用，更多的细菌及其产物由肠道进入肝，引发炎症和适应性免疫反应，进而导致肝纤维化的发生[48-49]。

综上，大肠杆菌可通过产生酒精和增加酒精代谢产物乙醛促进肝纤维化的形成与发展。

3.2 肠道菌群基于TLR4和TLR9介导炎症反应参与肝纤维化

3.2.1 TLR4分子

一般认为，肠道菌群对肝的致病机制主要是体内生态失调、肠道屏障受损和免疫系统状态的改变，导致细菌产物可通过门静脉到达肝，进而激活免疫系统，引发炎症反应[50]，其中肠道屏障受损是致病的中心环节。肠道通透性增加会导致血液中肠源性内毒素和病原相关分子模式（pathogenassociated molecular pattern，PAMP）水平增加。

研究表明，TLR4在肠上皮紧密连接屏障的调节中起着核心作用。而脂多糖（内毒素）可以通过诱导肠上皮细胞膜TLR4的表达和定位，引起肠紧密连接通透性增加[51]。已知缺陷的肠上皮紧密连接屏障会增加肠源性细菌抗原（主要为肠细菌源性脂多糖）的全身循环，而在全身循环中，脂多糖作为一种典型的PAMP，会与模式识别受体（pattern recognition receptor，PRR）结合，TLR在这个识别过程中起着重要作用[52-54]。TLR4被认为是脂多糖的模式识别受体。脂多糖与分布在肠道细胞中的TLR4结合，使肠道通透性增大。脂多糖发生细胞旁渗透，肠组织中脂多糖水平升高；脂多糖入血液，由门静脉入肝，与肝巨噬细胞（枯否细胞）上的TLR4发生特异性识别，进而激活免疫系统，诱发炎性反应，继而加快肝纤维化的进程[55]。

NF-κB与机体炎症、免疫活动密切相关，在各类细胞质中广泛存在，且其对细胞因子、转录因子、生长因子与趋化因子等众多物质的表达具有重要的调节作用[56]。其中结缔组织生长因子（connective tissue growth factor，CTGF/CCN2）和转化生长因子 β1（transforming growth factor-β1，TGF-β1）会对HSC活化及转化过程起促进作用[4]。由此可知，NF-κB可以通过对细胞因子的调控，起到阻止HSC凋亡，促使HSC活化和增殖[57-58]，进一步加剧肝纤维化的发生发展。TLR4缺陷（TLR4-/-）的肝纤维化小鼠NF-κB表达降低，菌群所致炎症缓解，肝纤维化程度减轻。由此推测TLR4减少会导致NF-κB表达降低，进而加速HSC凋亡并阻碍其活化，从而缓解肝纤维化的进程。

其次，存在于HSC中的TLR4的激活一方面会上调趋化因子的分泌，诱导枯否细胞趋化；另一方面会下调TGF-β伪受体（如BAMBI蛋白，其能够干扰TGF-βⅠ型和Ⅱ型受体复合物的形成，减弱TGF-β诱导的细胞生长阻滞及促进细胞迁移的作用[59]）的数量，从而提高 HSC 对 TGF-β 的敏感性[60]，促进HSC的活化。二者形成双重力量，加快肝纤维化进程。

3.2.2 TLR9分子

有研究表明，HSC表达TLR9，可被细菌DNA中存在的双核苷酸CpG激活。在CpG刺激下，从表达TLR9的小鼠中分离得到的HSC高表达单核细胞趋化蛋白1（monocyte chemoattractant protein-1，MCP-1）。相反，从TLR9缺陷小鼠分离的HSC缺乏CpG诱导的MCP-1表达[61-62]。此外，在TLR9-/-小鼠中，肝α平滑肌肌动蛋白（HSC活化标志物）的表达降低，表明细菌DNA可通过激活TLR9进而诱导HSC活化[61]。HSC可被TLR9激活，而TLR9是细菌DNA唯一已知受体，当肠道屏障功能受损时，大量细菌进入肝内与TLR9识别结合，促进HSC的活化，进而导致肝纤维化。

4 发生显著丰度改变的菌群可作为辅助诊断肝纤维化的标志物

发生肝纤维化时，肠道菌群的组成及其丰度会发生明显改变，越来越多的标志菌群被发现且有希望在今后临床诊断中起到一定的辅助作用。

研究表明，当肠黏膜阿克曼菌（Akkermansiaceae）丰度下降时，肠道黏液层变薄，肠道通透性增加，进而导致细菌及其代谢产物极易渗漏[61]，进而增加发生肝纤维化的风险。另外，在纤维化患者粪便样本中检测到变形菌门和大肠杆菌的丰度显著增加，而厚壁菌门则减少[19]。乙肝患者肠道菌群的丰度降低，且肠道菌群中的优势菌种如罗氏菌属（Rhodobacteria）等菌属丰度明显降低，而致病菌及条件致病菌如肠杆菌等则显著增加[63]。综上，发生显著丰度变化的特殊菌群可作为检测肝纤维化发生的标志菌群，如通过检测类杆菌等的异常降低和大肠杆菌等的异常增高来判断肝纤维化的发生。

另外，由普氏粪杆菌抗炎和保护肠道屏障功能、乳酸菌抑制有害菌生成和保护肠道屏障功能可知，当检测到患者粪便中的普氏粪杆菌或乳酸菌丰度异常降低时，可以推测该患者有患肝纤维化的可能。由雷氏普鲁威登斯菌通过产生大量TMA造成甘油三酯在肝内大量堆积，导致肝损伤和大肠杆菌产生酒精及乙醛可知，当检测到雷氏普鲁威登斯菌或大肠杆菌丰度大幅度增高时，要注意预防肝纤维化的发生。

5 从肠道菌群对肝纤维化的加速或延缓作用探索肝纤维化的治疗方法

基于肠道菌群及其介导的炎症反应对肝纤维化加速或延缓的作用，从而将肠道菌群丰度和多样性作为防治肝纤维化新的科学视野。

一方面，可以通过在肝纤维化发生发展中起促进或延缓作用的特殊菌群出发，通过抗生素、益生菌、益生元等策略影响相关菌群的丰度[64]，达到减缓肝纤维化发展的效果。施用抗生素可降低肠道菌群的丰度，从而消除生物失调，减少炎症细胞因子的产生，稳定肠道屏障，减少毒性胆汁酸的形成[65]。另外，益生菌具有直接的抗菌作用和免疫调节功能，可增强肠上皮细胞的屏障功能[66-67]。已知革兰阴性菌能够加速肝纤维化的发展，而乳酸杆菌、双歧杆菌（Bifidobacterium）是能够有效抑制革兰阴性病原菌增殖的益生菌[63]，由此可知，通过益生菌治疗可有效预防和缓解肝纤维化的发生与发展。半乳糖、乳果糖和菊粉等益生元可以作为有益菌的食物，并促进某些菌种的繁殖，特别对是乳酸杆菌的增殖具有较强的促进作用[3]，而乳酸杆菌又具有抑制有害菌生成和保护肠道屏障功能。临床试验发现，通过益生元治疗，非酒精性脂肪肝患者的身体质量指数、肝酶、血清胆固醇和甘油三酯均显著降低，表明益生元在治疗NAFLD中也发挥了一定作用[62]。

肠道屏障功能被破坏后，可通过阻断病原相关分子模式与模式识别受体的结合来减缓病情的发展。如可通过对细菌DNA内CpG的灭活来阻断其对TLR9的刺激，进而抑制HSC的活化。另外，基于脂多糖结合TLR4可知，当物质与脂多糖化学结构相似时，则与脂多糖竞争性结合TLR4，从而减缓对肠道屏障的破坏，同时抑制炎症反应的发生，进而抑制肝纤维化的进一步发展。

6 结语

在现阶段肝纤维化的临床诊断中，肝穿活检仍是主要的方法，但由于肝穿部位受到局限，很有可能导致其检测结果出现假阴性，因此以肠道菌群作为诊断的辅助标志能提高诊断的准确性。同时可以根据肠道菌群的组成和丰度的改变来判断肝纤维化的程度和致病原因，进而从根源上进行治疗。另外，根据肠道菌群促进肝纤维化的致病机制，可以肠道菌群作为切入点，通过减少特殊菌群的丰度和阻断炎症反应的中间环节来缓解肝纤维化。随着对肠道菌群的进一步研究，其与肝纤维化间的关系也将被进一步揭示，在今后肝纤维化的临床治疗中，以增加或减少肠道菌群丰度和多样性为理论指导的菌群移植治疗手段将进一步得到快速发展。