谷氨酸脱氢酶作为药物性肝损伤潜在生物标志物的研究进展

黎 韵，向怀荣，程 旋，何 贝，彭文兴,2

（中南大学1.湘雅二医院药学部，2.临床药学研究所，湖南长沙 410011）

药物性肝损伤（drug-induced liver injury，DILI）是人体暴露于特定药物后由药物本身或其代谢产物对肝的直接或间接作用而引起的肝损伤[1]。DILI是常见药物不良反应，可导致急性肝衰竭甚至死亡等严重不良预后[2-3]。在中国大陆，DILI发病率约为23.8/100 000，高于西方国家的报道[4]。根据机制DILI可分为固有型和特异质型。固有型DILI是指由药物或其代谢物直接损伤引起的DILI，与药物剂量正相关，可预测，潜伏期短，且个体间差异不明显。然而，大部分药物引起的DILI是特异质型DILI。特异质型DILI通常与药物剂量无关，个体间差异大，机制复杂，难以预防和诊断[5]。特异质型DILI难以在实验动物复制，临床表现多样，是医药公司、患者和临床医生密切关注的问题。特异质型DILI不仅是药物审批失败、增加警示以及退出市场的重要原因，也是临床出现不明原因肝损伤的重要原因[6]。对于DILI，迄今仍缺乏灵敏性高且特异性强的诊断标志物和有效的治疗方法，存在诊断和治疗两大困难。

谷氨酸脱氢酶（glutamate dehydrogenase，GLDH）是一种变构酶，主要催化谷氨酸氧化脱氨生成α-酮戊二酸的可逆反应，在胰岛素稳态[7]、调节中枢神经系统[8]和癌细胞繁殖[9]中发挥着重要作用。在人体，GLDH广泛存在于细胞内线粒体基质中，当线粒体遭到破坏时，GLDH从线粒体基质被释放到体循环中，导致血清中GLDH水平升高。另外，GLDH作为氨基酸代谢过程的关键酶在肝组织中含量最高[10]。且线粒体损伤是多数DILI机制的关键步骤，DILI发生时，血清GLDH水平会显著升高。因此，GLDH被视为DILI的潜在生物标志物[11-12]。最新研究表明，GLDH作为DILI的生物标志物在一定程度上优于其他传统生物标志物[11,13]。如2019年Church等[13]进行了一项国际合作的大型前瞻性研究，对miR-122、GLDH、炎症标志物高迁移率族蛋白B1（high mobility group protein B1，HMGB1）和骨桥蛋白（osteopontin，OPN）等DILI的候选生物标志物进行了比较研究，发现GLDH作为DILI的诊断标志物优于其他生物标志物。

1 传统DlLl生物标志物及其不足

传统肝功能指标是常用的DILI诊断指标，包括谷 丙 转 氨 酶（glutamic-pyruvic transaminase，GPT）、谷草转氨酶（glutamic-oxaloacetic transaminase，GOT）、碱性磷酸酶（alkaline phosphatase，ALP）、γ-谷氨酰转肽酶（γ-glutamyl transpeptidase，GGT）和总胆红素（total bilirubin，TBIL）等。目前临床诊断DILI的金标准为GPT，GOT，ALP和TBIL的联合检测。随着金标准被广泛应用于临床，这些传统生物标志物的不足逐渐显现。首先，这些传统生物标志物的肝特异性不强，肝以外的其他器官损伤也会导致它们的升高和假阳性诊断。如肌损伤可导致血清GPT升高；肾炎和肌损伤均可导致GOT升高[14-15]；ALP同时分布于肝组织和骨组织中，可随成骨细胞活性的升高而升高。妇女绝经后血清中的ALP水平升高，而绝经后妇女是DILI的高危人群，易导致假阳性诊断[16]；当血红蛋白降解增加或胆红素转运体发生改变时，血清中TBIL水平也会随之升高[17]。其次，这些传统生物标志物的灵敏性不高，部分患者在DILI发生的早期仅表现出金标准的血清水平轻微升高，甚至不升高，容易错过最佳诊疗时间，发生不可逆严重肝损伤，甚至导致肝衰竭，最后危及生命。总之，目前临床上使用的金标准不能早期、准确、特异地对DILI进行诊断，不利于及时对发生了DILI的患者进行干预。为更早、灵敏、特异地诊断DILI以减少DILI引起的严重肝损伤和死亡，寻找新的DILI生物标志物势在必行。

2 GLDH作为潜在DlLl生物标志物的特点

关于GLDH作为DILI的潜在生物标志物已有大量相关研究。下面对GLDH作为DILI生物标志物在生物学特性、肝损伤特异性、灵敏性和稳定性等4个方面的研究进展进行综述。

2.1 生物学特性

GLDH（EC 1.4.1.3）是由谷氨酸脱氢酶基因（NCBI序列号NC_000010.11）编码的一种酶。哺乳动物组织中GLDH由6个相同的亚基组成的六聚体分子组成，每个亚基的相对分子质量约为5.6×104，由505个氨基酸组成的多肽链组成。GLDH主要催化谷氨酸氧化脱氨生成α-酮戊二酸和氨，这一过程是机体获得ATP的重要途径。GPT（EC 2.6.1.2）和GOT（EC 2.6.1.1）是氨基酸代谢过程中重要的酶。GPT和GOT为蛋白单体，相对分子质量比GLDH小，但GLDH在结构、组织分布和功能上更保守，物种间转化率更高[18-19]。与GPT一样，GLDH是一种在肝组织中分布最多的酶，但两者在肝细胞内的分布不同[10]。GPT起源于胞浆，而GLDH位于线粒体基质中[18]。GLDH在含有富含基质的线粒体的肝组织中分布最广，而在含有富含嵴的线粒体的组织中，如心肌和骨骼肌，分布极少[19]。GLDH虽也存在于肾和神经组织中，但这些组织通常分别向管腔和脑脊液释放酶。

2.2 肝损伤特异性

与GPT相比，GLDH的肝特异性更强。GPT是一种在肝细胞含量较高的代谢酶，在肝细胞坏死过程中，细胞膜受到损坏，GPT被释放到血液中。然而，GPT不仅由肝细胞释放，也能在其他器官的细胞受到损伤时从中释放，如肾、肌肉和心脏等[10，19]。在剧烈运动[20-21]和心梗[14]后，血清GPT水平显著升高。此外，GPT的血清水平还受人体代谢变化的影响，如饥饿、糖尿病[22-23]或某些药物治疗期间[24]均会引起GPT血清水平的变化。因此，GPT的肝损伤特异性不足。GLDH虽在肾、胰腺、大脑和肠道有少量表达，在肌组织中也有微量表达，但主要在肝小叶中均匀表达[10]。基于GLDH的肝损伤特异性比GPT更强，美国FDA在2020年已批准了临床应用GLDH代替GPT联合其他生物标志物（如TBIL，GOT和ALP）作为肌损伤患者的肝损伤生物标志物[25]。

2.3 灵敏性

GPT等传统生物标志物不能较早诊断出DILI，存在患者病情严重而血清中的GPT水平仍处于正常水平的情况[26]。GLDH相较于传统生物标志物能更早地诊断出DILI，灵敏性更高。有研究显示，随着肝损伤的加重，相较于GPT，血清GLDH水平的升高能更早地被检测到[27]。在苍耳子水提取物致大鼠肝损伤研究中，可以观察到动物轻微肝损伤时GLDH明显升高，而传统生物标志物（如GPT和GOT）血清水平并未出现明显升高[28]。此外，在对乙酰氨基酚引起的肝损伤大鼠模型中，GLDH被证明是比GPT更灵敏的DILI生物标志物[29]。

2.4 稳定性

GLDH的稳定性表现在个体稳定性、药物稳定性和检测稳定性3个方面。在个体稳定性方面，GLDH在健康受试者血清中的浓度不受性别和年龄等因素的影响，稳定在1～10 U·L-1[30]，个体间差异小。药物稳定性体现在GLDH不易受到药物的抑制和诱导。某些药物可抑制GPT的表达并掩盖其血清水平的升高。在一项大鼠的急性肝损伤研究中发现，异烟肼和硝酸铅会抑制GPT的表达，环丙孕酮和地塞米松会诱导GPT的表达升高，Wyeth-14643会诱导ALP的表达升高，从而导致假阳性、假阴性结果，而血清GLDH的水平不受这些药物的影响[10]。检测稳定性体现在人血清中GLDH在室温下放置48 h，-20℃冷藏14 d或-80℃冷冻18个月后其水平仅轻微下降。且将3种GLDH含量不同的人血清在-80℃冷冻并融化4次后，在每个解冻循环后检测的样品中的GLDH浓度均在真实值的86%～103%范围内[31]。

3 GLDH与其他新型DlLl标志物比较

由于传统生物标志物存在的不足，除GLDH外，还出现了其他一些潜在的新型生物标志物，如：miR-122、HMGB1和OPN、细胞死亡标志物细胞角蛋白 18（cytokeratin 18 protein，CK18）等。miR-122是肝组织中含量最高的微RNA，在成年小鼠肝组织中占70%，在人肝组织中占52%[32]，在肝损伤时会释放到血液循环中。miR-122的肝损伤特异性比GLDH更强，但其个体间的差异大，稳定性比GLDH差[13]。HMGB1是一种核内蛋白，其血清水平升高提示细胞损伤或炎症反应，在肝损伤中比传统生物标志物升高更早[32]。然而HMGB1在淋巴、脑和肝等组织中均广泛大量分布从而缺乏肝特异性，且其个体内的差异大，特异性和敏感性均比GLDH差[33]。CK18是一种细胞死亡的标志物，可作为早期检测肝细胞坏死和凋亡的标志物。OPN是一种多功能蛋白，其血清水平与肝损伤程度相关。与GLDH相比，CK18和OPN对不良预后具有更强的诊断力，但它们同样在体内广泛分布，缺乏肝损伤特异性[34-35]。GLDH还具有检测方法简便的优势。目前GLDH采用速率法来检测其活性。样本中的GLDH在还原型辅酶Ⅰ（NADH）存在下催化α-酮戊二酸与氨反应生成L-谷氨酸和水，同时NADH被氧化，氧化速率与GLDH的活性成正相关，NADH在340 nm处有吸收峰，通过监测340 nm处吸光度的下降速率即可计算出样本中GLDH活性[36]。根据这个原理，GLDH的活性测定可采用全自动生化分析仪来完成。该法操作简便，技术成熟，而其他新型生物标志物检测方法复杂、繁琐，技术含量高。总之，GLDH与其他新型生物标志物相比，在肝特异性和灵敏度，个体间和个体内稳定性，检测方法等方面的综合能力更具优势。

4 问题与展望

GLDH比肝损伤传统生物标志物特异性更强、灵敏性更高、稳定性更好。与其他新型生物标志物相比较，GLDH比miR-122的个体间和个体内差异小，比HMGB1，OPN和CK18的肝损伤特异性和灵敏性更好。此外，GLDH比这些新型生物标志物更易于检测。GLDH作为DILI的潜在循环生物标志物显示出很大的应用潜力，具有很好的临床应用前景。但GLDH作为DILI潜在生物标志物存在以下不足：①血清中GLDH水平的升高不一定能真实反映临床意义上的DILI。2014年，Singhal等[37]研究发现，服用消胆胺的67名受试者中有11名受试者未引起DILI，但血清GLDH有升高的现象，其平均水平升高了7.3倍。2012年，Harrill等[38]研究发现，使用肝素的48名健康志愿者中有4例未引起DILI，但出现血清GLDH异常的现象，升高水平在4～14倍。以上研究中，GPT，HMGB1和miR-122的血清水平也存在异常升高现象。②由于GLDH主要存在于线粒体基质中，所以仅在涉及线粒体损伤的DILI时才会释放GLDH到血液中。但随着对DILI的机制的进一步认识，未来也许能利用GLDH与其他生物标志物联合检测的方式来克服其缺点，从而提高诊断的准确性，应用于临床。

未来，GLDH将主要用于以下几个方面：①联合传统或其他新型DILI标志物作为新的DILI标志物。大量研究证实，每个生物标志物都只能反映肝的某一方面的功能，不能代表肝功能的整体变化，因此在诊断肝损伤时不能单独用一个生物标志物，应联合检测优势互补的生物标志物。如GLDH作为线粒体损伤标志物可与氧化应激、细胞坏死凋亡或炎症标志物进行联合检测，更准确地诊断DILI，为临床治疗提供科学参考。②用于研究DILI的相关机制。GLDH作为线粒体损伤标志物能反映线粒体的损伤情况，以进一步了解到线粒体功能障碍在DILI中的作用，对不同药物引起的DILI机制研究有重大意义。③作为DILI治疗后恢复程度判定指标。GLDH的血清水平与肝损伤程度呈正相关，患者病情加重时则GLDH血清水平升高。GLDH的半衰期较短，可实时反映肝损伤和恢复的情况。