高效液相色谱法测定美白化妆品中12种美白功能物质的含量

杨婷婷,李 杰,吉伟佳,易路遥

(江西省药品检验检测研究院,国家药品监督管理局中成药质量评价重点实验室,江西省药品与医疗器械质量工程技术研究中心,南昌 330029)

美白化妆品是指有助于降低皮肤色素沉着速率,达到皮肤增白效果的化妆品,通过添加具备阻断酪氨酸酶活性或还原黑色素等功能物质来达到美白的作用[1-4]。对2012年至2016年我国原国家食品药品监督管理总局审批的祛斑/美白类产品进行调查[5],结果发现使用1种或2种美白功能物质的情况较为普遍。还有许多学者致力于研究开发具有协同作用的新型美白功能物质[6-7]。美白功能物质的复配添加使用正成为发展趋势,然而其真实添加水平还需要进一步探究。

目前,我国对于美白功能物质的使用规格、限量要求等还未作出具体规定,化妆品中美白功能物质的添加种类是否与标签相符、添加量是否在安全水平,这在美白化妆品的风险监测工作中尤为重要,也给监管人员对同时检测美白化妆品中多种美白功能物质提出了更高的要求。关于美白功能物质的测定方法主要有高效液相色谱法[8-9]和高效液相色谱-质谱联用法[10]等。我国《化妆品安全技术规范》(2015版)对祛斑/美白类化妆品中禁用组分氢醌和苯酚的检测方法有具体规定[11],该规定和国家标准方法GB/T 35954-2018《化妆品中10种美白祛斑剂的测定 高效液相色谱法》对10种美白功能物质的测定提供了指定方法(高效液相色谱法)[11-12]。但是,当前对于美白功能物质的测定及限量要求还未形成较统一的规定,对于美白功能物质的监管还未形成一套系统的方法。本工作将风险较高的禁用物质氢醌和当前舆论讨论较多的物质苯乙基间苯二酚一并加入研究,在现有研究基础上,提出了高效液相色谱法测定12种美白功能物质含量的方法,并对试验条件进行了优化,以便掌握美白化妆品中美白功能物质的风险评估基础数据,从而进一步推动制订美白功能物质准用清单,为日后靶向性监管美白化妆品提供一定的思路。

1 试验部分

1.1 仪器与试剂

Agilent 1260Ⅱ型高效液相色谱仪;MicroPure UV/UF型超纯水系统;KQ500E型超声波清洗器;ST16 R型冷冻离心机。

单标准储备溶液:1.000 g·L-1,分别精密称取阿魏酸、3-O-乙基抗坏血酸、苯乙基间苯二酚标准品25 mg,用甲醇溶解,转移至25 mL容量瓶中,用甲醇定容;分别精密称取氢醌、4-丁基间苯二酚标准品25 mg,用少量甲醇溶解,转移至25 mL容量瓶中,再用水定容;分别精密称取抗坏血酸磷酸酯镁、抗坏血酸葡糖苷、曲酸、β-熊果苷、烟酰胺、覆盆子葡糖苷、甲氧基水杨酸钾标准品25 mg,用水溶解,转移至25 mL容量瓶中,用水定容。

混合标准储备溶液:100 mg·L-1,分别准确移取适量的上述12种单标准储备溶液于10 mL容量瓶,用50%(体积分数,下同)甲醇溶液稀释成质量浓度约为100 mg·L-1的混合标准储备溶液,于2～8℃储存备用。

混合标准溶液系列:分别移取适量的混合标准储备溶液置于不同的5 mL容量瓶中,用50%甲醇溶液定容,摇匀,配制成抗坏血酸磷酸酯镁的质量浓度为4.7,9.4,23.6,47.1,94.3 mg·L-1,抗坏血酸葡糖苷的质量浓度为6.3,12.6,31.6,63.1,126.2 mg·L-1,β-熊果苷的质量浓度为6.7,13.5,33.7,67.4,134.9 mg·L-1,曲酸的质量浓度为5.2,10.3,25.8,51.7,103.4 mg·L-1,氢醌的质量浓度为6.9,13.7,34.3,68.6,137.1 mg·L-1,烟酰胺的质量浓度为4.3,8.5,21.3,42.6,85.1 mg·L-1,3-O-乙基抗坏血酸的质量浓度为8.0,16.0,40.1,80.2,160.5 mg·L-1,阿魏 酸 的 质 量 浓 度为5.5,11.0,27.5,55.0,110.1 mg·L-1,覆盆子葡糖苷的质量浓度为5.6,11.2,28.0,56.0,111.9 mg·L-1,甲氧基水杨酸钾的质量浓度为4.3,8.6,21.5,43.1,86.2 mg·L-1,4-丁基间 苯 二 酚 的 质 量浓度为5.1,10.2,25.6,51.1,102.2 mg·L-1,苯乙基间苯二酚的质量浓度为6.6,13.2,33.0,66.0,131.9 mg·L-1的混合标准溶液系列。

抗坏血酸磷酸酯镁、抗坏血酸葡糖苷、曲酸、β-熊果苷、3-O-乙基抗坏血酸、甲氧基水杨酸钾、覆盆子葡糖苷、4-丁基间苯二酚、苯乙基间苯二酚标准品的纯度均大于97%;氢醌标准品的纯度为99.5%;烟酰胺、阿魏酸标准品的纯度均大于99%;甲醇为色谱纯;磷酸二氢钾为分析纯;试验用水为超纯水。

试验所用美白化妆品均来自市售产品,产品名称标示美白、皙白、焕白、净白、嫩白等。

1.2 仪器工作条件

SHI MADZU Shi m-pack GIS-C18色谱柱(250 mm×4.6 mm,1.8μm);柱温30℃;进样量10μL;3种 检 测 波 长230,250,280 nm;流 量1.0 mL·min-1;流动相A为0.02 mol·L-1磷酸二氢钾溶液(p H 6.00),B为甲醇;梯度洗脱程序:0～4 min时,A为92%;4～9 min时,A由92%降至85%;9～17 min时,A由85%降至10%,保持4 min;21～23 min时,A由10%升至92%。

1.3 试验方法

精密称取均匀样品0.20 g,置于10 mL具塞比色管中,加50%甲醇溶液8 mL,涡旋至样品完全分散,超声15 min,冷却至室温后用50%甲醇溶液定容至10 mL,摇匀,以转速5 000 r·min-1离心5 min,上清液过0.45μm有机系滤膜,滤液按照仪器工作条件测定。

2 结果与讨论

2.1 流动相的选择

试验考察了甲醇-0.02 mol·L-1磷酸二氢钾溶液(p H 6.00)、甲醇-0.02 mol·L-1甲酸铵溶液、甲醇-0.05%(体积分数)甲酸溶液等流动相体系的分离效果。结果显示:含甲酸或甲酸铵的体系对β-熊果苷和曲酸的洗脱能力较弱,出峰时间延后,两峰无法有效分离;而以甲醇-0.02 mol·L-1磷酸二氢钾溶液(p H 6.00)体系为流动相时,β-熊果苷和曲酸可以较好分离,同时其他目标物的色谱峰峰形也较好,分离效果较佳。因此,试验以甲醇-0.02 mol·L-1磷酸二氢钾溶液(p H 6.00)体系为流动相。

2.2 色谱柱的选择

美白功能物质的分析均采用C18色谱柱,但在实际检测工作中发现不同品牌的C18色谱柱对多组分的分离效果会有较大差异,尤其是对于分离时间接近的组分,有些品牌的C18色谱柱可以达到有效分离,有些品牌的则出现分离度不满足要求的情况。因此,试验对比了Agilent ZORBAX SB-C18(250 mm×4.6 mm,5 μm)、SVEA Opal-C18(250 mm×4.6 mm,5 μm)、SHI MADZU Shi mpack GIS-C18(250 mm×4.6 mm,5μm)等3种不同品牌色谱柱的分离效果。结果显示:采用Agilent ZORBAX SB-C18色谱柱时,阿魏酸、3-O-乙基抗坏血酸和甲氧基水杨酸钾等3种物质无法分离;采用SVEA Opal-C18色谱柱时,抗坏血酸磷酸酯镁和抗坏血酸葡糖苷的分离效果不好,4-丁基间苯二酚和苯乙基间苯二酚的分离效果不好,阿魏酸和3-O-乙基抗坏血酸无法分离;12种物质在SHI MADZU Shi m-pack GIS-C18色谱柱上分离效果较好,且峰形良好。综上,试验选择SHI MADZU Shi m-pack GIS-C18色谱柱进行实际样品的分析。

2.3 检测波长的选择

采用U-3900型紫外-可见分光光度计对12种美白功能物质进行全波段(190～400 nm)扫描。其中,抗坏血酸磷酸酯镁、抗坏血酸葡糖苷、曲酸、3-O-乙基抗坏血酸、甲氧基水杨酸钾的最大吸收波长在246～270 nm内;覆盆子葡糖苷、β-熊果苷、烟酰胺的最大吸收波长在215～222 nm内;氢醌、阿魏酸的最大吸收波长分别为291,320 nm;4-丁基间苯二酚、苯乙基间苯二酚的最大吸收波长分别为280,252 nm,但实际检测中这两个组分在230 nm处的峰更高。综合考虑实际的色谱图,β-熊果苷、烟酰胺、覆盆子葡糖苷、4-丁基间苯二酚、苯乙基间苯二酚选用230 nm为检测波长,抗坏血酸磷酸酯镁、抗坏血酸葡糖苷、曲酸、3-O-乙基抗坏血酸、甲氧基水杨酸钾选用250 nm为检测波长,氢醌和阿魏酸选用280 nm为检测波长。100 mg·L-1混合标准储备溶液在3种检测波长下的色谱图如图1所示。

图1 3种检测波长下的色谱图Fig.1 Chr o matogra ms at 3 detection wavelengt hs

2.4 提取溶剂的选择

选取两种不同基质(水剂、霜剂)样品进行回收试验,分别选取两种提取溶剂(50%甲醇溶液8 mL,二氯甲烷2 mL＋50%甲醇溶液6 mL)进行处理,添加质量分数为0.012 5%的混合标准溶液,计算两种不同基质样品的回收率,结果见表1。

表1 提取溶剂对目标物回收率的影响Tab.1 Effect of extraction solvent on recovery of targets

表1 (续)

由表1可知:以50%甲醇溶液8 mL为提取溶剂进行前处理时,水剂样品中12种目标物的回收率为71.6%～102%,霜剂样品中12种目标物的回收率为73.9%～103%;而以二氯甲烷2 mL＋50%甲醇溶液6 mL为提取溶剂进行前处理时,霜剂中甲氧基水杨酸钾表现出极差的回收效果,回收率仅为25.9%,原因是霜剂组分较为复杂,可能存在某种物质和甲氧基水杨酸钾结合,导致无法很好将其提取,另外,两种不同基质样品中大多目标物的回收率偏高,最高达到136%。综合考虑,试验选取50%甲醇溶液8 mL为提取溶剂。

2.5 标准曲线和检出限

精密移取混合标准溶液系列注入高效液相色谱仪进行测定,以各目标物的质量浓度为横坐标,对应的峰面积为纵坐标,绘制标准曲线,所得线性参数如表2所示。

以3倍信噪比(S/N)计算检出限(3S/N),结果见表2。

表2 线性参数和检出限Tab.2 Linearity par ameters and detection limits

2.6 精密度和回收试验

精密移取10 mg·L-1混合标准溶液注入高效液相色谱仪,重复进样6次,记录峰面积,计算12种目标物峰面积的相对标准偏差(RSD),结果为0.18%～1.3%,说明仪器精密度满足测定要求。

选取两种不同基质(水剂、霜剂)样品,添加质量分数为0.0125%的混合标准溶液,设置6份平行,按照试验方法测定,计算回收率和测定值的RSD,结果见表3。

表3 精密度和回收试验(n＝6)Tab.3 Results of tests for precision and recovery(n＝6)

2.7 样品分析

采用上述建立的方法对市售的52批样品进行分析。结果显示:所有样品均未检出我国禁用物质氢醌;以检出1～2种美白功能物质为主,检出率最高(48%)的是烟酰胺,共计25批,本次分析对象中将近一半的样品添加使用了烟酰胺,质量分数为0.004%～4.7%,其次是β-熊果苷,共计10批,质量分数为0.02%～2.6%,其余检出美白功能物质还有3-O-乙基抗坏血酸(5批)、抗坏血酸磷酸酯镁(2批)、抗坏血酸葡糖苷(2批)、甲氧基水杨酸钾(2批)、苯乙基间苯二酚(1批);另外,有12批样品未检出标签标示美白功能物质,5批样品检出标签未标示美白功能物质。还发现一批进口焕白洁面乳标签未标示任何美白功能物质,同时也未检出任何美白功能物质,该产品的真实美白功能到底有多少值得思考,对进口美白产品的质量控制需要引起重视。

本工作提出了同时测定12种美白功能物质的高效液相色谱法,并对方法的回收率、精密度及检出限进行考察,方法前处理操作简单,适用性强,适用于美白化妆品中多种美白物质的快速筛查,可为化妆品的安全监管提供技术支撑。同时,在实际样品检测中发现,美白化妆品成分表存在标签标示混乱的现象,需要技术监管部门提高重视,更好地规范美白化妆品的生产流通。