雌激素受体、芳香化酶、卵黄蛋白原研究进展

常菊花 李少斌 田晓丽

长江大学生命科学学院 湖北荆州 434025

1 生物标志物简介

简单的急性毒性试验不能准确地反映当今环境污染物的污染现状，所以低剂量的慢性和亚慢性试验越来越受到重视。生物检测包括体内试验(In vivo test)和体外试验(In vitro test)。通常，体内试验指以活体动物为对象进行环境污染物的内分泌干扰作用的研究。体外试验的设计基于大部分内分泌干扰物在体内的作用机制。鱼类经常被用生殖或内分泌毒理学研究，鱼类慢性活体试验常与生物标志物联系起来。目前生物标志物(biomarker)可分效应标志物(effect biomarker)、暴露标志物(exposure biomarker)和易感性标志物(susceptibility biomarker)三类。效应标志物是指生物暴露于污染物后可测出的生理、生化、行为或其他改变的指标。暴露标志物指测定生物组织、体液或排泄物中吸收的污染物本身、其代谢产物或者与内源物质的反应产物。易感性生物标志物是针对不同个体对外源性化合物的生物易感性指标，易感性的形成的一个主要原因是基因的多态性。

2006年世界自然基金会列出了具有生殖—内分泌干扰效应的化学物质，农药类环境激素所占比例最大，其中农药及其代谢物有九十多种。

表1 具有生殖—内分泌干扰效应农药列表Table1 WWF list of pesticides with reproductive or endocrine disrupting effects

2 硬骨鱼雌激素受体

1962年，Jensen等用放射配体结合分析法(radio ligand binding assay，RU)首先证实了雌激素受体(Estrogen receptor，ER)的存在。ER是一种糖蛋白，分子量约35000～90000，具有特异性强，亲和力高，结合能量低的特性，ER的生物特性极不稳定，与雌二醇(E2)结合后的复合物则较稳定。雌激素受体由三个独立但又相互影响的功能区构成：氨基末端、DNA结合区域(DNA binding domain，DBD)和羟基末端的配体结合区(1igand binding domain，LBD)。

与高等脊椎动物不同的是，多数硬骨鱼类中ERβ存在异型体，它们分别由两个不同基因(ERβ1和ERβ2)编码。硬骨鱼类ER种类和生理功能状况远比高等脊椎动物复杂。关于雌激素受体的研究，硬骨鱼远远落后于哺乳动物。到目前为止，在NCBI数据库中已经登录了虹鳟(Oncorhynchusmykiss)、青鳉(medaka)、梭鱼(Mugilsoiuy)、稀有鮈鲫(Gobiocyprisrarus)、拟鲤(Rutilusrutilus)、鲶鱼(catfish)和黑头软口鲦(FatheadMinnow)等雌激素受体序列。黑头软口鲦(FatheadMinnow)组织分布分析表明，ERmRNAs在两性鱼类的脑、垂体、肝脏和性腺的表达非常高，在肠、腮和肌肉也有表达。目前雌激素受体的研究主要集中在对雌激素受体的识别、定位、基因克隆、基因表达上，对其三维结构的研究很少。

3 硬骨鱼芳香化酶

芳香化酶可以催化雄激素转化为雌激素，是雌激素合成中的关键酶。芳香化酶基因是目前了解比较清楚的影响鱼类性别的基因，芳香化酶抑制剂可抑制日本褐牙鲆(Paralichthysolivaceus)P450arom mRNA表达而成为表型雄鱼。赤点石斑鱼两种芳香化酶分别由不同的基因编码。脑芳香化酶(P450aromB)的cDNA全长为1901 bp，编码509氨基酸；性腺芳香化酶(P450aromA)的cDNA全长为1833 bp，编码518氨基酸。序列分析结果表明，赤点石斑鱼两种芳香化酶cDNA序列的同源性为51.6%。芳香化酶可以影响鱼类的性腺发育和性别转化、血清中性类固醇激素含量等。鱼脑和垂体中的芳香化酶水平比其他脊椎动物高出100～1000倍。在鱼类性别分化和性逆转实验中，芳香化酶是相对研究较多的一种酶类，它的活性和表达的强弱，在一定程度上可以反映出雌激素的生物合成状况。目前许多硬骨鱼类P450芳香化酶的cDNA已被克隆，这些cDNA编码的氨基酸序列与两栖类、鸟类、哺乳类等芳香化酶cDNA编码的氨基酸序列同源性较高，表明芳香化酶在进化上和功能上相当保守。

4 硬骨鱼卵黄蛋白原

卵黄蛋白原是卵黄蛋白的前体，它对鱼类的生殖非常重要。肝脏VTG合成过程是下丘脑一垂体一性腺神经内分泌轴通过环境或内源信号激活下发生的自然过程。一般只有在性成熟的雌鱼体内，足够量的雌激素(17β-雌二醇)作用于肝脏肝细胞膜上的雌激素受体，从而诱导卵黄蛋白原基因表达，产生卵黄蛋白原。随后VTG进入血液循环达到卵巢，进入卵母细胞，分解成卵黄脂磷蛋白和卵黄高磷蛋白，用作初生胚胎的营养和能量来源，支持胚胎发育。卵黄蛋白原只在成熟雌性卵生动物体内表达，幼年和雄性动物体内则无，但是可以在外源性雌激素诱导其表达。卵黄蛋白原(Vitellogenin)可以考虑作为一个指示环境内分泌干扰物污染的生物标志物。

5 展望

对硬骨鱼雌激素、芳香化酶、卵黄蛋白原的结构和功能研究可以进一步为生物标志物的选择提供理论依据。