两种精子优化处理方法对体外受精-胚胎移植结局的影响

王惠洁 余秋锋 高松城 黄智勇 叶秀云

（1 韶关市妇幼保健院，广东 韶关 512000；2 翁源县妇幼保健院，广东 翁源 512600）

体外受精-胚胎移植技术（in vitro fertilization and embryo transfer，IVF-ET）即俗称的“试管婴儿”，是现阶段对于不孕不育治疗的一个重要方式，对于不孕不育患者来讲是个福音。精液优化处理是该项技术中的一个重要环节，其目的是将精液中的精浆分离出，将其他有害物质、死精子、畸形精子、细胞碎片去除，进而将一定数量成熟，同时存在受精潜能的前线运动精子优选出来[1]。现阶段，临床以密度梯度离心法、上游法等为常用的两种优选方式。本中心在2019年前，IVF-ET周期中用于精液优化处理的方法大多为梯度离心合并上游法。自2019年始，我中心才大规模的增加单纯上游法用于精液处理方法。于是将我中心2019—2021年标准人群IVF-ET第一周期人群，不同精液处理方法胚胎结局的进行如下比较。

1 资料与方法

1.1 一般资料 选取2019年1月至2021年12月我院辅助生殖治疗IVF标准患者结局进行研究。本研究不违反国家法律法规，符合医学伦理原则。促排方案选择：长效长方案，减少促排卵方案对结局的影响。纳入标准：IVF-ET第一周期；女方年龄＜35岁；确定移植日内膜≥7 mm，获卵数为5～15个。排除标准：男方处理后精子浓度＜3.0×106/L；子宫肌瘤肌瘤、畸形等形态异常；女方存在全身性疾病。妊娠判断标准：胚胎移植后28～35 d超声提示宫内探及孕囊回声为临床妊娠。本研究课题时间较长，纳入周期可统持续妊娠率，活产率还未完全出齐。

1.2 方法

1.2.1 样本收集 男方禁欲2～7 d后经手淫法收集精液，根据WHO人类精子检测手册（第5版）记录精子体积、性状、pH值、浓度、活力等；女性患者则实施促排卵方案，在体内的卵泡发育成熟后对其进行人绒毛促性腺激素注射，剂量为10 000 U或5 000 U，35～36 h 后，通过阴道超声的引导下实施卵泡穿刺取卵。

1.3.2 精液处理方法 ①上游法：将收集液化完全精液缓慢注入含有3.0 mL Plus-IVF液体的10 mL规格试管底部，45 ℃静置15～20 min，之后缓慢吸取最上层液体0.4 mL于5 mL小试管，放入培养箱待用。②密度梯度合并上游法：将收集液化完全精液缓慢滴入盛有由PremGad配成1.5 mL 40%、1.5 mL 80%梯度液离心管的上方，离心300 g，15 min。将离心后沉淀加入盛有1.5 mL Plus-IVF液体5 mL小试管中混匀。离心 300 g，3 min，弃上清。沿管壁缓慢滴入1.0 mL plus-IVF放入37 ℃培养箱上游15 min，之后吸取最上层液体0.4 mL液体至小试管中。

1.3.3 体外受精、陪同培养和移植 在取卵后4 h左右，在存在卵子的培养皿中加入经过优化处理过的精子，对精子浓度合理调整，在35.5 ℃、5%的CO2培养箱中进行为期16～20 h的培养后，颗粒进行机械法脱掉，对受精情况进行观察，第3日对卵裂情况进行观察，同时进行准确记录，对胚胎进行评分后进行胚胎冷冻或胚胎移植。

1.3 观察指标

1.3.1 胚胎结局 对比两组患者正常受精率、优胚率、多PN率、可用胚胎囊胚形成率、正常卵裂率、可用囊胚形成率、妊娠率、着床率、流产率、持续妊娠率。

1.3.2 胚胎的评分标准 按照细胞数、细胞大小是否均匀、多少碎片等情况评价卵裂期胚胎质量。见表1。

表1 胚胎的评分标准

1.4 统计学处理 采用SPSS 18.0统计学软件对数据进行分析。计量资料采用（）表示，组间比较行t检验；计数资料采用[n（%）]表示，组间比较行χ2检验；P＜0.05表示差异有统计学意义。

2 结果

2.1 不同分组周期一般情况比较 回顾分析2019年 1月至2021年12月符合试验条件：男方处理后精子浓度≥3.0×106/L 35岁以内、获卵5～15个、内膜≥ 7 mm、IVF-ET第一周期的助孕移植的女性患者，不同精液处理前一般情况：上游法、梯度离心合并上游法分组的患者中年龄、血清抗苗勒管激素、Gn时间、Gn总数、子宫内膜厚度、获卵数均无差别（P＞0.05）。见表2。

表2 不同精液处理方法一般资料比较（）

表2 不同精液处理方法一般资料比较（）

注：各组方差均齐，使用方差分析，P＞0.05，两组样本来自同一标准人群。

2.2 两组精液处理法胚胎结局比较 经一般资料比较发现，上游法和梯度离心合并上游法具有样本选择的随机性、同质性。接下来进行正常受精率、正常卵裂率、优胚率、可用胚胎囊胚形成率、可用囊胚形成率、着床率、妊娠率、流产率、持续妊娠率的比较。两种精液处理方法在优胚率方面差异有统计学意义（P＜0.05）。上游法优胚率45.85%大于梯度离心法40.42%。两种精液处理方法在正常受精率、多PN率、正常卵裂率、可用胚胎囊胚形成率、可用囊胚形成率、着床率、妊娠率、流产率、持续妊娠率差异均无统计学意义（P＞0.05）。但上游法可用囊胚形成率高于梯度离心法4.01%、上游法着床率高于梯度离心法3.02%、上游法妊娠率高于梯度离心法4.04%、上游法持续妊娠率高于梯度离心法4.71%，而流产率上游法比梯度离心法低1.64%。可能由于样本量少，没有统计学意义，并不代表没有实际差别。见表3。

表3 两种精液处理对胚胎结局比较

3 讨论

人工方法在辅助生殖技术中将染色质完整性好、核成熟度、形态正常、活力好的精子是IVF-ET取得成功的关键因素。处理精液的目的是将精浆中的碎片、畸形精子、抗精子抗体、细菌、免疫活性细胞、死亡精子、前列腺素等其他有害物质。这可能对精子的活力或其受精能力产生影响或抑制，引起子宫痉挛，还可能对卵细胞产生损伤，对于早期胚胎发育产生组织作用。将精浆除去的目的是因为精浆可能将艾滋病等传染性疾病风险去除；将精液的黏稠性减少；达到合乎要求的活动精子密度；对精子获能促进，对精子受精能力改善。但因为精浆存在对精子功能保护的主要抗氧化物质，将精浆去除的同时也会导致精子的氧化应激损伤，使DNA断裂的概率增加。有学者指出，精液处理技术应用期间的反复离心会使活性氧类物质显著增加，引起精子出现氧化应激性DNA损伤，利用该类精子实施ART治疗，会降低妊娠率、受精率，同时易引起反复的自然流畅[2]。理想的精子分离技术需要包括如下几点：①操作简单、费用低、快速。②获得多量活动精子。③不损伤精子或分离后的精子并没有出现生理性改变。④尽量将其他细胞和死精子去除，包括细菌、白细胞。⑤去除ROS或其他活性物质或有毒的物质。⑥可以对多体积的精液处理。但是现有的技术对于全部的要求常常不能满足，现阶段临床以密度梯度离心法、上游法为临床常用方法。上游法的原理：活动精子能经过液界面而到不同的培养液中，可以使精子与无用物质自行分离而重新分布，无用物质包括其他有害成分、凝集精子、杂质、畸形精子、活力差的精子、白细胞、死精子、杂质。但是该种方法获得了高质量的精子，但是存在较低的精子回收率。有学者指出，上游法优选出的精子存在很好的运动参数，活率也较高，但是对于完整精子顶体的比例并不能提升[3]。而上游法可得到很多的存在完整顶体区域的椭圆形精子[4]。上游法也可以不成熟以及染色体异常的精子，同时也有学者指出，用精子染色质结构分析法的过程中检测了Percoll梯度离心法和上游法对精子优选，都获得了正常形态、活动良好的精子，但是后者可以将精子DNA完整性提升，但是前者却不能[5]。同Ixa Prep梯度离心法、Pure Sperm相比，上游法可以将一氧化氮产量有效降低，前者可以将精子的运动特性，继而将其作为精子毒物，是因为鸟苷酸环化酶的激活使cGMP的产生增加，且该物质会对精子的运动性产生抑制作用。密度梯度离心法的原理：采取密度梯度不同液体放在试管中，保证其无毒、无菌，试管底部为密度最大者，依次向上递减，表面密度最小，则构成了不连续的密度梯度，在密度最底层的上方放置液化后的精液，离心后，所需要的活动力强的精子在试管最底部[6]。同上游法对比，密度梯度离心法对于更多形态正常的精子可以得到，会显著增加精子的活力、体外生存能力，特别是那些畸形精子症状、弱精症、少精症等存在更高的因回收率，此法更加合适。Percoll梯度离心法在优选精子中的历史已经超过20年，该种方式不但简便，同时存在较高的活动精子回收率。但是Percoll液中存在PVP可导致女性生殖道内膜乃至腹膜出现炎性反应，美国自1996年起，该种方式只在试验室中应用，对于临床中禁用，之后便将不含PVP的替代液Pure Sperm等开发出来[7]。Pure Sperm离心法同Percoll离心法存在的优选精子的效果相近，同时对于精子来劲并没有毒性作用[8]。有研究报道，密度梯度离心法可以将染色体浓缩差、DNA断裂的精子分离出来[9]。有学者认为，密度梯度离心法对异常精子处理后，获得的精子的低渗肿胀试验阳性率、顶体反应率同成熟的精子比例同上游法相比更佳[10]。

上述很多的研究结果都不同，可能同进行优选处理的精子样本质量存在联系。而本中心摸索出的上游法+密度梯度离心法是以传统的密度梯度离心法为基础采取了不含离心操作的上游过程，在理论上，将两种精子处理方法的优点结合在一起；精子存在加工的回收率，同时可以二次对回收的精子筛选，同时对于损伤精子DNA的程度并不增加，进而确保了用于受精的精子的质量。本文分析我中心2019—2021年IVFET周期标准患者472例，比较不同精液处理方法对标准人群胚胎结局的差别。通过上游法与梯度离心合并上游法胚胎结局的比较发现，上游法在优胚率方面有统计学优势，在可用囊胚形成率、着床率、妊娠率、持续妊娠率均有数据优势；在流产率方面数据也是最低。分析原因可能是梯度离心合并上游法可以筛选核成熟的精子，但是经过离心又增加了氧化应激，造成DNA断裂损伤，染色质交联异常，影响精子受精后胚胎结局；也可能是样本量不够大，没有得出统计差别，今后研究继续增加样本量，继而获得更加准确的研究结果。

总而言之，对于精子的处理方法可以结合临床的具体情况进行优化处理，进而获得更加优质的精子，提升妊娠率，改善妊娠结局。