近十年溃疡性结肠炎动物模型的研究❋

张晓梅， 黄木圣， 范春娇， 林星阳 ， 高松林， 黄贵华

(1.广西中医药大学， 南宁 530001；2.广西中医药大学第一附属医院， 南宁 530023)

溃疡性结肠炎(ulcerative colitis, UC)是一种目前病因不明确的结肠和直肠的慢性非特异性炎症性疾病,主要包括腹痛、腹泻、黏液脓血便和里急后重等临床表现,其发病率在全球范围内呈现逐年上升趋势，但产生此疾病的具体病因及发病机制尚不完善1、2]。因此，需要制作UC动物模型进行实验研究,以期深入研究其发病机制。本文就几种常用溃疡性结肠炎模型的造模方法、方法评价等进行归纳总结，以期为实验研究选择较理想的造模方法提供理论支持。

1 UC动物模型的制作方法

1.1 免疫法

1.1.1 结肠黏膜组织致敏法 此方法将Frend佐剂(弗氏佐剂)加入大鼠或者其他动物的结肠黏膜组织制作的匀浆中，然后每只大鼠足垫内的部位注射上述混合液的上清液，剂量为0.1～0.3 mL，时间分别为第1天和第15天。当第17、24、30天时分别在大鼠的背部、腹股沟及腹腔内注射同样的上清液(剂量也同上)，但是第30天注射时不加Frend佐剂，当腹腔注射5 d后，可以明显观察到大鼠出现UC样症状，并取其结肠组织进行病理检测[3，4]。

该模型的稳定性好, 临床相近度高,得出的结果更接近实际,可以应用于抗溃疡性结肠炎药物的筛选实验。此方法的制作过程相对其他方法复杂, 造模时间长，可复制性较差，且成功的关键在于Frend佐剂的配制，因此需要相应的条件、设备及掌握相关的技术,否则难以达到实验想要的效果, 所以目前实验研究较少应用此类方法。

1.1.2 胎鼠结肠种植法 该方法在无菌条件下将抗原(胎鼠结肠)手术移植于成年鼠(同系)的肾包膜下，手术完成后，正常饲养20 d，然后取其结肠组织观察其病理改变[5]。

本方法的产生原理是细胞免疫反应(宿主抗移植反应)，制作出来的模型临床相似度高，当进行防治溃疡性结肠炎的免疫药理学研究时，可将其作为较为理想的动物模型。实验需要无菌操作，且周期长、技术难度大且有局限性，成功率低，因此较少应用[6]。

1.1.3 大鼠结肠细菌菌株法 实验选择正常大鼠肠道的大肠杆菌作为抗原,将其注入实验大鼠体内,使大鼠发生免疫反应, 从而大鼠结肠壁表现出溃疡或炎症反应[7]。

此造模方法过程简单，价格低廉, 与人UC的临床表现相似且容易成功，是较理想的病因学研究模型。实验需要制备大肠杆菌混悬液且周期长，因此只适合于有技术条件的实验者[8]。

1.2 化学法

1.2.1 葡聚糖硫酸钠(dextran sulfate sodium，DSS)自由饮 袁权利等[9]采用2% DSS溶液代替饮用水，第1周、第2周后均腹腔注射1次15 mg/kg AOM，即可成功造成UC模型。陈素傲等[10]采用2%～5%DSS溶液饮用5～7 d可制成急性UC模型，反复周期性给予DSS溶液则可诱导慢性UC模型。王亚梅等[11]采取自由灌喂的方式,让小鼠连续2周饮用浓度为4%的DSS溶液, 建立慢性UC的模型。

此方法操作不复杂容易得出结果，且临床相似度、可重复性高。但是大鼠饮用DSS的量无法准确控制，从而导致组内大鼠病变差异大[12]。

1.2.2 乙酸(acetic acid,AA) 杨永刚等[13]采取腹腔注射30 mg/kg戊巴比妥钠的方式对大鼠进行麻醉，然后将直径3 mm的灌肠硅胶管经其肛门缓慢插入约8 cm，缓慢注入1.5 mL 10%的乙酸溶液，10～15 s后生理盐水灌肠清洗，即建模完成。张勇等[14]采取腹腔注射300 mg/kg水合氯醛的方式对大鼠进行麻醉，然后将直径2 mm的灌肠硅胶管经其肛门缓慢插入约8 cm，缓慢注入1 mL 8%的乙酸溶液，10～15 s后生理盐水灌肠清洗，即建模完成。

其操作方法简单，材料来源方便、成本低，因此应用广泛。乙酸刺激后该模型容易发生自愈, 比较适用于研究急性UC模型的药物疗效和黏膜愈合机制，但在研究免疫机理、药物药效等方面不适用[15]。

1.2.3 恶唑酮(oxazolone,OXZ) 王艳红等[16]制作方法总结如下：首先对小鼠注射乙醚麻醉，然后在小鼠肛门插入硅胶管深4 cm,注入150 μL唑酮 (6 mg溶于50%乙醇中)于硅胶管，让其缓慢流入小鼠体内。此操作完成后，为防止漏液将小鼠倒放30 s即可。周瑾等[17]将0.3 mL 3%的恶唑酮(溶于100%乙醇溶液中)涂抹在腹部(剃毛)，隔天再涂抹1次，然后禁食不禁水24 h后进行麻醉，再从肛门注入0.3 mL 1%的恶唑酮溶液(溶于50%乙醇中)，倒置大鼠60 s，按压其肛门口约2 min，让其自然清醒，正常饲养1 d后，重复上述灌肠操作。

其制作简单，容易掌握，可复制性强、成本低。病情不持续，自愈性强,没有慢性炎症的表现, 因此不能用于慢性溃疡性结肠炎的研究[18]。

1.2.4 角叉菜胶 在研究对象饮水中加入3%～5%降解的角叉菜胶水溶液，经过一段时间后，研究对象产生UC模型的典型症状[19]。

其方法简单，容易操作，肠道炎症表现持续时间长，能够很好地诠释疾病的慢性病程。病变反应多发生在盲肠，临床症状持续时间短，此方法在实际操作中多用豚鼠为实验对象且需要反复造模，因此代价高昂，故目前临床多不采用此方法造模[20]。

1.3 复合法

1.3.1 三硝基苯磺酸(trinitrobenzene sulfonic acid，TNBS)/乙醇诱导 江巧丽等[21]先将小鼠禁食不禁水24 h,再注射40 mg/kg戊巴比妥钠进行腹腔麻醉，然后将橡胶软管插入小鼠肛门深8 cm，将混合液(0.6 mL TNBS+ 0.25 mL乙醇溶液)注入橡胶软管，将小鼠倒立30 s(防止漏液)后，平放使其自然恢复，即制成UC模型。黎笑兰等[22]给大鼠腹腔注射30 mg/kg戊巴比妥钠进行麻醉，橡胶软管从肛门插入至距肛门8 cm处，缓慢注入0.8 mL的三硝基苯磺酸(溶于50%乙醇中)，让液体缓慢流入小鼠体内，此操作完成后，为防止漏液将小鼠倒放30 s即可。刘喜平等[23]采用腹腔注射7%水合氯醛进行麻醉后，在石蜡油润滑的情况下，将橡胶软管经肠道缓插8 cm入结肠，然后推入0.8 mL 的药物(100 mg/kg的TNBS与等体积50%乙醇混合)，再注入0.5 mL空气,将大鼠倒置1 min防止漏液，然后等其自然醒,每周1次,连续5周，即造模完成。李盼盼等[24]用4%水合氯醛进行麻醉，将经过石蜡油润滑后的硅胶管由肛门缓慢插入深8 cm，缓慢注入约1 mL 100 mg/kg 的TNBS溶液(溶于50%乙醇溶液中)，倒置大鼠60 s按压其肛门口，即建立溃疡性结肠炎的模型。刘佳丽等[25]实验证明，不同造模次数造成大鼠溃疡性结肠炎的效果不同。结果表明，持续3次采取100 mg/kg TNBS+乙醇溶液对大鼠进行灌肠更容易成功建立UC模型。

TNBS/乙醇诱导是大家比较认可、应用最广泛的方法之一,其操作简单,临床相似度高，可复制性强, 病情持续时间长、成本低，慢性炎症表现比较明显，为探索新的慢性炎症治疗药物提供了条件。

1.3.2 乙酸复合刺激法 卢倩等[26]、徐雨生等[27]则选择异体抗原联合醋酸的方法进行UC造模。现配制异体抗原乳化剂，然后在大鼠左侧足跖、右侧足趾、腹股沟、背部皮下、腹腔分别注射0.1 mL上述试剂(其中成分包含8 mg抗原以及0.05 mL完全Frend佐剂)，时间分别为第1、8、15、22、29天 ，第29天注射时不加佐剂。上述操作完成后大鼠禁食不禁水24 h，然后大鼠用1 mL 5%的醋酸溶液进行灌肠,溶液在大鼠体内停留30 s后,用4 mL氯化钠溶液冲洗肠道，再用1 mL异体抗原乳化剂重复灌肠。同样将液体留置体内，时间为30 min，并重复上述冲洗步骤，即造模完成。

此方法造出的模型具有免疫异常、局部炎症等2种表现且成功率高，可复制性强，死亡率低，适合与UC相关的研究。该过程复杂、操作困难、难以掌握且周期长，故当前研究较少选择此类方法。

1.3.3 二硝基氯苯(DNCB)/乙酸诱导 陈梦梦等[28]UC造模方法如下：首先制备20 g/L的2,4-二硝基氯苯丙酮液、0.1%的2,4-二硝基氯苯乙醇等液体，在每只大鼠脱毛处(大鼠背部)给予0.3 mL 的2,4-二硝基氯苯丙酮液，每日1次，重复上述操作14 d。第15天将聚乙烯导管插入肛门深8 cm，并注入0.25 mL 0.1%的 2,4-二硝基氯苯乙醇溶液于管道，让溶液流入动物体内；第16天从管道再次注射2 mL 80 mL/L的醋酸溶液，15 s后用生理盐水冲，即造模完成。张艳晓等[29]造模方法如下：首先大鼠禁食36 h(不禁水)，在每只大鼠背部脱毛处先一层涂猪油，再给予0.3 mL的2% DNCB丙酮液，每日1次，重复上述操作14 d。第30天将聚乙烯导管插入肛门深8 cm，并注入0.3 mL 0.1%的 2,4-二硝基氯苯乙醇溶液于管道，第31天再次从管道注射2 mL 0.2%的醋酸溶液，15 s后用生理盐水冲，即造模完成。

模型临床表现持续时间长，与人UC相似度高，造模容易成功且重复性高。整个过程非常繁琐,造模时间长且DNCB有毒,容易导致动物死亡。

1.4 中医证型动物模型法

王爱华等[30]、刘香玉等[31]建立脾肾阳虚型UC模型，分别用番泻叶灌胃+氢化可的松腹腔注射和大黄水煎液灌胃+氢化可的松肌注的方式，但都采取TNBS/乙醇诱导法建立UC大鼠模型。柳荣等[32]总结肝郁脾虚型UC模型建立方法中提出束缚法+饮食失节刺激+TNBS/乙醇诱导的方式比较好并有两种方式：第一种是先限制饮食行动后，再采用TNBS/乙醇诱导法进行灌肠；第二种是先限制饮食行动1周后，通过TNBS/乙醇混合液灌肠造模，然后再进行限制饮食行动2周。姜小艳等[33]双日给予大鼠猪油(4 mL 1只,每日1次)，每天将大鼠站立在2 cm的水里并保持8 h，持续20 d，第21天采取TNBS/乙醇诱导法进行造模，此方法统一称为“内外因+三硝基苯磺酸”(TNBS)法。石磊等[34]建造寒热错杂证UC大鼠模型方法，大鼠禁食不禁水24 h后进行腹腔麻醉，麻醉后将经过润滑后的乳胶软管插入肛门(深8 cm),随后1 min内推入0.6 mL的药物(100 mg/kg的TNBS与33. 3%乙醇混合)，让大鼠仰卧位保持15 min后使其自然清醒，此操作每天1次，持续3 d。

中医证型动物模型(脾肾阳虚型、肝郁脾虚型、寒热错杂证等)能够更好地体现UC的西医病理和中医病机等特点，也更适合药效的观察与评价，但是此模型只复制了一部分证候表现，中医诊断疾病的重要指征(舌象、脉象等)无法在模型中得到体现。虽然目前中医证型动物模型法是较为合理的一种，但仅以部分临床表现作为判断依据，其模型评价的标准仍不够客观与合理。因此，为建立更符合人类疾病的中医证型动物模型，仍需要进一步的探讨[35]。

1.5 其他造模方法

溃疡性结肠炎动物模型除以上列举的造模方法之外，还有DNCB或者TNBS诱导法、DSS复合法、恶唑酮+乙醇诱导法、自发模型法、基因模型法、细菌感染法等，其中DNCB或者TNBS诱导法是化学法的一种，而DSS复合法、恶唑酮+乙醇诱导法则属于复合法。TNBS单独诱导法的操作方法如下[36]：小鼠禁食24 h(不禁水)，然后采用10%的水合氯醛进行腹腔麻醉(0.25 mL/100 g)，麻醉后直接用灌胃针将TNBS溶液注入动物肠腔内，并将其倒立1 min即可。此方法的优点是操作方便，重复性好，实验周期短且成本低，而缺点是TNBS溶液的剂量不好掌控，当TNBS的量过小时自愈性强，炎症时间短，而TNBS的量过大时，其死亡率高。DNCB诱导法建立的UC模型具有自愈性强等特性,有实验证明DNCB加乙酸能够克服DNCB造成的动物自愈性，因此临床大多采用DNCB加乙酸的方法建立UC模型。

DSS复合法建立的UC模型与人类极其相似，但是因为DSS的成本过高，妨碍此方法的推广。恶唑酮+TNBS诱导法建立的模型虽然克服了单独使用TNBS诱导时模型出现局部炎症轻的缺点，又弥补了单独使用OXZ诱导时动物出现炎症反应不持续的不足，但其操作复杂，实验周期长，由此临床较少应用。

自发模型法建立的模型因为其疾病自发的特点，成为最贴近UC的模型，但是因为来源稀少，成本高昂，限制了此造模方法的实际应用。基因模型法建立的模型包含基因敲除型、转基因型等。基因动物模型对研究疾病的发生机制、病因以及药物治疗效果具有较强的优势，但是需要较高的技术支撑且代价昂贵，因此还在进一步研究中，临床上应用不多。

2 结语

综上所述, 溃疡性结肠炎动物模型的建立方法大概包括免疫法、化学法、复合法、中医证型动物模型法，以及自发模型法、基因模型法、细菌感染法等，上述每个方法都有其优缺点，临床研究大多采用化学法和复合法，其中尤以乙酸法、DSS自由饮和TNBS/乙醇诱导法最为常用。免疫法、自发模型法、基因模型法、细菌感染法等均存在技术要求高、实验周期长、价格昂贵等缺点，由此临床多不采用此类方法。根据中医理论病证结合方法建立的中医证候模型，体现了UC的西医病理和中医病机，是目前比较合理的一种造模方法，但仍然不够全面，但随着模型研究的深入及想法的不断创新，此方法将被更多人承认，也会为以后的中医药基础研究的前进提供支持，期望在未来能更多地从病证结合角度发展UC模型的建立以及治疗。前期的模型建立对实验是否成功起着至关重要的作用。判断模型成功的方法，如肉眼观察实验动物是否发生腹泻、便血等病症，临床检测包括粪便检查、白细胞计数、内镜检查、免疫学检测等，实验检测则包括DAI、MPO、结肠病理组织检查等。现实中由于多种原因的限制，前期实验必须对动物的造模方式进行选择。由此本文就UC造模方法进行分析，以期为实验研究选择较理想的造模方法提供理论支持。