线粒体动力相关蛋白1 与帕金森病相关性研究

赵振荣史 洺刘继红邵思迈游言文张紫娟郝 莉张振强

(1.河南中医药大学医学院,郑州 450046;2.河南中医药大学中医药科学院,郑州 450046)

帕金森病(Parkinson’s disease,PD)的主要症状是运动迟缓、静止性震颤和肌强直[1]。 PD主要神经病理改变是中脑黑质多巴胺能神经元变性死亡,由此引起纹状体多巴胺含量减少和α-突触核蛋白(α-synuclein,α-syn)沉积。 这些病理改变可能与神经元氧化应激、炎症反应和线粒体功能障碍等有关。 线粒体功能障碍可由多种原因引起,如线粒体生物发生障碍、活性氧(reactive oxygen species,ROS)生成增加及线粒体动力学异常等[2]。 近年来,PD 中线粒体动力学异常引起了广泛关注。 所以,本文就线粒体动力学、线粒体动力相关蛋白1 及其与PD 中异常表达的α-syn、LRRK、PINK1、Parkin 等的病理关系进行综述。

1 线粒体动力学

线粒体是存在于大多数真核细胞中的细胞器[3],是一系列细胞生命过程如三磷酸腺苷(Adenosine triphosphate,ATP)的产生、关键代谢物的合成、内源性ROS 的产生等,并且是细胞程序性和非程序性死亡发生的场所[4]。 线粒体动力学是指线粒体通过不断的分裂和融合,为细胞提供能量,调节细胞自噬和凋亡的过程[5]。 其中,线粒体分裂有利于新线粒体的生物发生和通过自噬清除功能异常的线粒体,动力相关蛋白1(dynaminrelated protein1,Drp1)参与的线粒体分裂异常可引起神经退行性病变、心血管疾病和癌症等[6];线粒体融合包括线粒体融合蛋白1(mitofusion 1,Mfn1)和线粒体融合蛋白2(mitofusion 2,Mfn2)介导的外膜融合和由视神经萎缩症蛋白1(optic atrophy 1,OPA1)介导的内膜融合,融合缺陷可引起线粒体DNA 丢失[7]。 分裂与融合的动态平衡有助于维持线粒体的正常功能[8]。

2 线粒体动力相关蛋白1

Drp1 又名DNM1L(dynamin-1 like)[9],正常情况下,Drp1 主要分布于细胞质内,可维持线粒体动力学平衡,调节分裂和融合。 线粒体分裂时,细胞质内的Drp1 被募集到分裂处,水解GTP 释放能量,微管环收缩继而切断线粒体。 随着Drp1 的表达水平降低,分裂逐渐停止,转向融合[10]。 因此,Drp1水平的上调或下调可用于检测线粒体动力学的变化。

Drp1 由Shin 等[11]首先报道,分布于人的12p11.21,小鼠的16 和大鼠的11q23[12]。 人Drp1有六个剪接变体:变体1 编码736 个氨基酸,分子量为81.6×103;变体2 外显子15 被剪切;变体3 编码699 个氨基酸,外显子15 和16 被剪切;变体4 编码725 个氨基酸;变体5 编码710 个氨基酸;变体6 编码749 个氨基酸[13]。 与人Drp1 相似,小鼠也存在Drp1 的多种变体。 变体1 编码712 个氨基酸组成,分子量为78.3×103;变体2 的外显子3 被剪接掉;变体3 的外显子15 和16 被剪接掉[13]。

Drp1 是一种高度保守的 GTP (Guanosine triphosphate)酶,包括4 个结构域[12]。 不同结构域的不同位点可以与线粒体外膜上的受体结合,其中GTP 酶结构域与线粒体外膜上的受体结合;中间结构域主要介导Drp1 的寡聚化,裂变过程由Drp1 在分裂点周围形成环状螺旋结构,然后由GTP 酶依赖性收缩;C 末端GTP 酶效应结构域刺激GTP 酶的活性并介导Drp1 同源二聚体复合物的形成和稳定[14]。

Drp1 翻译后修饰主要包括磷酸化、小泛素相关修饰物(smallubiquitin-relatedmodifier,SUMO)化、泛素化和S-亚硝基化,它们调控着Drp1 的活性。Ser637 的磷酸化抑制Drp1 活性,而Ser616 的磷酸化激活Drp1 活性。 当SUMO 蛋白附着在Drp1 上时,有助于Drp1 修饰,尤其是在线粒体外膜(outer mitochondrial membrane, OMM)。 然而, Drp1 在OMM 的SUMO 化结果尚不明确。 定位于线粒体外膜的E3 泛素连接酶可使从胞质转移到线粒体的Drp1 发生泛素化,并被蛋白酶体降解,同时诱导线粒体自噬。 Drp1 中Cys644 半胱氨酸残基的S-亚硝基化增强Drp1 活性,促进线粒体分裂[15]。

3 Drp1 参与PD 的病理过程

PD 是仅次于阿尔茨海默病(Aizheimer’ s disease,AD)的第二大神经退行性疾病[16]。 1-甲基-4-苯基-1,2,3,6-四氢吡啶(1-methyl-4-phenyl-1,2,3,6-tetrahydropyridine,MPTP)促进Drp1 表达,继而引起ATP 减少和ROS 产生增多[17]。 MPTP 可选择性引起多巴胺神经元变性损伤[18]。 由于1-甲基-4-苯基-吡啶离子(1-methyl-4-phenylpyridinium,MPP+)是MPTP 的活性代谢物,被选择性地吸收到DA 神经元中,抑制线粒体复合物I 的活性,减少ATP 合成[19]。 研究发现,MPP+可使Drp1 表达增加,导致处于融合、分裂平衡的线粒体趋向于过度分裂,出现线粒体碎片化并伴有线粒体功能障碍,这些改变的出现早于神经元自噬和死亡[20]。 所以在PD 神经毒素模型中,Drp1 在介导MPP+毒性中发挥了重要作用[21]。

PD 黑质中残存的神经元胞质内不溶性α-syn聚集形成路易小体。 PD 模型发生机制研究表明,αsyn 通过调节分裂、融合蛋白影响线粒体动力学[22]。α-syn 定位于线粒体膜,影响线粒体分裂,直接或间接影响着Drp1 活性。 α-syn 促进Drp1 从细胞质移位至线粒体外膜,与相应受体结合,形成螺旋寡聚体,包裹线粒体使其分裂[23],同时还可引起线粒体自噬减少[22]。 实验发现α-syn 聚集形成的毒性可被Drp1 抑制剂降低,这进一步说明α-syn 聚集与Drp1 介导的线粒体分裂相关[24]。 但是,PD 中线粒体分裂主要是由α-syn 触发还是由α-syn 与Drp1 之间的相互作用引起的仍不清楚[25]。

LRRK2(Leucine-rich repeat kinase 2)是PD 的致病基因[26],具有调控囊泡运输、自噬、氧化应激、神经毒性和线粒体动力学等功能。 LRRK2 基因编码的蛋白包含功能性激酶和GTP 酶结构域。LRRK2 在多巴胺能神经元表达高于其他神经元,促使Drp1 从胞质向线粒体转移和募集[27]。 LRRK2通过转移磷酸盐来增加线粒体自噬,从而激活Drp1。 Ho 等[28]等发现LRRK2 通过Drp1 以激酶依赖性方式引起神经元线粒体分裂和动力学失衡,继而参与PD 病理过程。 LRRK2 基因突变与PD 相关,G2019S 是LRRK2 家族中最常见的致病突变,它可增加激酶活性。 PD 模型中,野生型LRRK2 直接与Drp1 相互作用,导致线粒体分裂,这在G2019S LRRK2 突变中更加明显[29]。

PINK1(PTEN induced putative kinase 1)与PD相关,是丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶,主要位于OMM,促进PD 中受损的线粒体通过自噬被清除[30]。PINK1 可在Ser616 位点磷酸化Drp1,缺乏PINK1的细胞和小鼠组织中Drp1 Ser616 磷酸化明显降低。在PINK1 突变的PD 患者成纤维细胞中检测到Drp1 Ser616 磷酸化降低[31]。 PINK1 通过抑制Drp1从胞质移位线粒体,恢复线粒体功能,减少线粒体分裂,保护神经细胞免受损伤[32]。 PD 线虫模型中,ROS 的产生和线粒体膜电位的丢失上调Drp1 表达,进行PINK1 依赖的线粒体分裂和自噬[33]。 PINK1缺陷果蝇的线粒体复合体I 的功能受影响,引起线粒体膜电位降低和ATP 减少[34]。 在PINK1 基因敲除小鼠中,Drp1 抑制剂可促进多巴胺的释放,改善线粒体功能障碍和缓解氧化应激。

Parkin 是一种E3 泛素连接酶,也是PD 相关蛋白。 Parkin 可在体内外与Drp1 相互作用并泛素化Drp1,促进其蛋白酶体降解。 若Parkin 突变或敲低可使Drp1 泛素化和降解均减少,Drp1 活性增强和线粒体分裂增加,最终导致PD[35]。 Parkin 在神经元过度表达不仅会增加线粒体数量还能延长果蝇的寿命。

PINK1 对底物的磷酸化有利于Parkin 从胞质移位到线粒体和参与后续的线粒体自噬[36]。PINK1 和Parkin 突变的果蝇体内,过表达Drp1 引起线粒体过度分裂,分裂后形成的碎片通过线粒体自噬消除[37]。 PINK1 或Parkin 功能缺失会增加Drp1依赖的线粒体片段化[38]。 在PD 的Drp1 敲低或敲除模型中,PINK1/Parkin 调节的线粒体自噬在黑质中受到明显抑制,这提示Drp1 参与了PINK1/Parkin调节的线粒体自噬,Drp1 在其中除了依赖性线粒体分裂作用以外,是否还有其他的作用方式还需进一步的实验证实。

4 Drp1 作为治疗靶点的相关研究

诱发PD 的神经毒素和相关蛋白与线粒体动力学有关。 神经毒素如6-羟基多巴胺、鱼藤酮和MPP+可诱导Drp1 从胞质转移至线粒体,引起线粒体分裂,从而导致多巴胺能神经元缺失。 PD 相关蛋白如Pink1、Parkin 和α-syn 可通过Drp1 调控线粒体融合/分裂来影响线粒体形态和功能。 另外,条件性敲除Drp1 的小鼠黑质和纹状体多巴胺能神经元容易受到分裂蛋白缺失的影响。 因此,PD 中靶向Drp1 介导的线粒体分裂对抑制神经变性非常重要。

十余年来,线粒体分裂抑制剂的开发取得了一定的进展。 第一个线粒体分裂抑制剂 1(mitochondrial division inhibitor 1,Mdivi-1)可透过血脑屏障、特异性降低Drp1 活性。 2008 年,Cassidy-Stone 等[39]在酵母中发现Mdivi-1 可明显减弱线粒体分裂,是DNM1 的GTP 酶特异性抑制剂。 随后,Mdivi-1 逐渐被证实可阻止人和哺乳动物细胞中的Drp1 从胞质转移到OMM 聚集,可防止GTP 酶激活水解GTP 和Drp1 寡聚化,从而抑制线粒体分裂,增加线粒体网络稳定。 此外,Reddy 等[40]研究表明,Midvi-1 在降低Drp1 的同时,增加线粒体融合蛋白水平,这说明Midvi-1 在抑制分裂的同时可促进融合。

Mdivi-1 在Pink1 基因敲除和MPTP 处理的PD小鼠模型中具有神经保护作用[41]。 在过表达人A53T 突变α-syn 基因的PD 大鼠模型体内的实验结果显示Mdivi-1 减少了神经变性、α-syn 聚集,并使模型大鼠运动功能正常化,这可能与Mdivi-1 减少线粒体过度分裂、改善氧化应激有关[24]。 PD 中,Pink1 突变促进线粒体分裂并阻止融合,而Mdivi-1明显减轻了Pink1 突变诱导的线粒体缺陷[42]。 这些结果表明Drp1 是一种治疗PD 的潜在靶点,特异性抑制Drp1 活性可直接减少线粒体分裂和片段化,进而缓解或逆转PD 症状。 截至目前,Mdivi-1 是研究最多的Drp1 抑制剂,但是,实验结果尚未显示Mdivi-1 在PD 中如何影响Drp1 的GTP 酶活性及其机制,因此,需要进一步研究Mdivi-1 如何靶向PD中神经元Drp1 和线粒体分裂。

另一种Drp1 选择性抑制剂是P110,它是一种能透过血脑屏障的生物可利用肽。 P110 通过减少线粒体碎片和ROS 产生来改善线粒体膜电位,减少PD 细胞模型中多巴胺能神经元的丢失[43]。 在加入MPP+的神经元中,P110 通过抑制Drp1 介导的线粒体功能障碍来减少多巴胺能神经元变性[44]。LRRK2 G2019S 突变是PD 最常见的遗传原因。P110 减少了携带LRRK2 G2019S 的PD 患者成纤维细胞的线粒体分裂,并降低了自噬水平。 LRRK2 G2019S 在Ser595 直接结合并磷酸化Drp1,而P110可消除这种磷酸化,抑制了Drp1 活性[45]。 除了磷酸化,目前尚不清楚P110 是否还能通过其他修饰方式起作用。

另外,Dynasore 是一种细胞渗透分子,它不仅会产生一种构象来阻止Drp1 聚合,还会阻止Drp1 的GTP 水解[46]。 Mitoquinone 是一种线粒体靶向抗氧化剂,它通过抑制Drp1 从胞质转向线粒体,明显减轻由PD 相关神经毒素诱导的线粒体分裂[47]。

5 结语

Drp1 对于线粒体分裂至关重要,PD 中Drp1 表达水平升高,增加的Drp1 会导致线粒体过度分裂、融合减少以及线粒体功能缺陷。 降低Drp1 表达水平可减少线粒体分裂,有助于维持线粒体稳态,这对于治疗PD 起到了重要作用。

目前,在Drp1 抑制剂Mdivi-1、P110 和Dynasore等的体内外研究中已初步取得了一些成果[48]。 因此以Drp1 为切入点开发线粒体分裂的抑制剂有望成为治疗PD 等神经退行性疾病的新靶标。 但是,现有的Drp1 抑制剂在不同PD 模型中作用机制尚不十分明确,进一步深入研究其中的作用机制是当务之急。 从而为Drp1 抑制剂应用于PD 等神经退行性疾病的临床治疗奠定坚实的理论和实验基础。