抗冠状病毒药物研究进展

秦聖乐王玉涛蔡雪君王新华杨子峰

(广州医科大学附属第一医院,广州呼吸健康研究院,呼吸疾病国家重点实验室,广州 510182)

新冠疫情已在世界范围大流行,死亡人数超过520 万, SevereAcuteRespiratorySyndrome Coronavirus 2(SARS-CoV-2)是一种新型的人类感染性β 冠状病毒[1]。 迄今为止,已发现7 种冠状病毒可引起人类呼吸道疾病。 冠状病毒是有包膜、单股正链Ribonucleic Acid(RNA)病毒,分为α、β、γ、δ 4 个属,其中α、β 冠状病毒属与人类疾病有关。 目前引起人类呼吸道疾病的冠状病毒Human coronavirus 229E(HCoV-229E)、Human coronavirus NL63(HCoVNL63)属于α 属,Human coronavirus OC43(HCoVOC43)、Human coronavirus HKU-1(HCoV-HKU-1)、SARS-CoV、 MiddleEastrespiratorysyndrome coronavirus (MERS-CoV)、SARS-CoV-2 属于β 属。HCoV-229E、HCoV-NL63、HCoV-OC43、HCoV-HKU-1冠状病毒可引起轻度呼吸道疾病,在免疫力低下人群中,还会引起肺炎和下呼吸道疾病[2]。 SARSCoV、MERS-CoV、SARS-CoV-2 病毒有高变异性和传染性,可引起严重急性呼吸道综合征。 由于RNA 病毒的高变异性,使得药物研究困难重重。 本文对以冠状病毒刺突蛋白,RNA 依赖性RNA 聚合酶,3C样蛋白酶以及抗冠状病毒中药的体内研究现状进行综述,为抗冠状病毒药物研究提供理论依据。

1 冠状病毒复制周期

吸附与进入:冠状病毒是有包膜、单股正链RNA 病毒。 病毒的膜表面有3 种蛋白,分别是刺突蛋(spike protein,S 蛋白)、包膜蛋白(envelope protein, E 蛋白)、膜蛋白(membrane protein,M 蛋白),其中S 蛋白是病毒入侵宿主细胞的关键[3]。病毒进入人体后,其S 蛋白被宿主蛋白酶切割成S1和S2 两个亚基,S1 亚基的受体结合区域与受体结合,病毒黏附在宿主细胞表面,S2 构象发生改变。病毒进入细胞包括膜融合和内吞两种方式,S2 的两个串联域七肽重复序列1(heptad repeat domains 1,HR1)和七肽重复序列2(heptad repeat domains,HR2),介导病毒与细胞之间膜融合途径,使病毒进入宿主细胞[4],如MERS-CoV 病毒[5];此外,低pH值和pH 依赖性的内质体半胱氨酸蛋白酶等组织蛋白酶协助冠状病毒由内吞途径进入宿主细胞,如SARS-CoV 和SARS-CoV-2 病毒[6-7]。

复制与转录:病毒基因组的复制和转录主要是由病毒的复制酶介导。 病毒进入宿主细胞并脱壳,病毒基因组RNA 释放到细胞质中后,Open Reading Frame 1a (ORF 1a)、 ORF 1b 翻译多聚蛋白(polyprotein,pp)pp1a 和pp1ab,pp1a 和pp1ab 随后被木瓜蛋白酶样蛋白酶(papain-like protease,PLpro)和3C 样蛋白酶(chymotrypsin-like protease,3CLpro) 切割, 产生 15 ～ 16 个非结构蛋白(nonstructure protein,NSPs),NSPs 组装成复制-转录复合物(replicase-transcriptase complex,RTC),负责病毒 RNA 的复制和多个亚基因组 RNA(subgenomic RNAs,sgRNAs)的转录。 冠状病毒复制以其正链RNA 为模板,通过RNA 依赖性RNA 聚合酶(RNA-dependent RNA polymerase,RdRp)生成全长的反义负链模板,用于合成新的基因组RNA 和重叠的亚基因组负链模板。

蛋白翻译:亚基因组mRNAs 的翻译产生病毒的结构蛋白和辅助蛋白,如刺突蛋白(S)、核衣壳磷酸蛋白(N)、血凝素-酯酶糖蛋白(HE)、膜糖蛋白(M)、外膜蛋白(E)在内质网进行翻译,并转运至高尔基体[8]。

组装与释放:病毒颗粒组装过程主要是在内质网-高尔基体中间体中发生,N 蛋白与新生的基因组RNA 在胞浆内组成螺旋核衣壳,核衣壳首先与M蛋白结合,E 蛋白与M 蛋白相互作用引发芽生,包装核衣壳。 S 蛋白与HE 蛋白在翻译时形成三聚体,包装到成熟的病毒颗粒,最后通过胞吐释放到胞外。

2 基于病毒蛋白靶点的抗冠状病毒药物

病毒复制周期中的酶和蛋白都是抗冠状病毒药物潜在的作用靶点,目前对于抗冠状病毒药物的研究热点主要集中在S 蛋白、 RdRp、 3CLpro、PLpro 等。

2.1 靶向于病毒刺突(S)蛋白

刺突(S)蛋白属于病毒的结构蛋白,成熟的S蛋白为稳定的三聚体,具有受体及膜融合活性,S1和S2 之间存在蛋白酶的裂解位点,S 蛋白的裂解活化是病毒入侵宿主细胞的关键[3]。 S 蛋白上的受体结合域(receptor-bindingdomain,RBD)与细胞表面受体结合,使病毒黏附于细胞表面,不同的冠状病毒其受体不同,亲和力也有区别,MERS-CoV 以人细胞表面蛋白二肽基肽酶4(dipeptidyl peptidase-4,DPP4)作为进入受体,而SARS-CoV-2 和SARS-CoV以血管紧张素转化酶II(angiotensin-converting 2,ACE2)作为受体,由于SARS-CoV-2 的S 蛋白与ACE2 受体亲和力比SARS-CoV 高20 倍,导致该病毒在人类中的传播速度更快[9]。

SARS-CoV-2 不仅需要ACE2 作为进入受体,还须同时结合位于细胞表面上的硫酸乙酰肝素(heparan sulfate,HS)才能进入宿主细胞,肝素结构上类似于HS,可结合并诱导SARS-CoV-2 S 蛋白受体结合域构象变化,抑制SARS-CoV-2 对Vero 细胞的感染[10],此外,肝素是一种硫酸多糖,有研究证实海参硫酸多糖(SCSP)可能通过抑制HS 和S 蛋白结合,阻止SARS-CoV-2 进入宿主细胞[11]。

部分药物可通过直接与病毒S 蛋白结合,如单克隆抗体7D10 与MERS-CoV S 蛋白的N 端结构域(amino terminal domain,NTD)结合,与DPP4 竞争性结合病毒S 蛋白,抑制了S 蛋白融合前到融合后的构象变化,从而阻止MERS-CoV 进入宿主细胞[12]。或通过其他方式作用于S 蛋白,如重组蛋白Griffithsin 与SARS-CoV 的S 蛋白存在多个具有高亲和力结合位点,但其并不抑制S 蛋白与ACE2 结合,研究表明Griffithsin 在体外可预防SARS-CoV 感染,预处理可预防小鼠致命性的肺部感染,减轻小鼠肺部病理改变,降低小鼠肺部炎症因子IL-1α、IL-1β、IL-6、G-CSF、MCP-1、和IL-12 的表达[13]。 化合物阳离子改性壳聚糖N-(2-羟丙基)-3-三甲基铵壳聚糖氯(HTCC)通过与病毒S 蛋白之间的静电相互作用,有效地阻断了MERS-CoV 和SARS-CoV-2 进入宿主细胞,且通过微调HTCC 可以靶向其他冠状病毒,但目前该化合物尚未用于人类,需要进一步深入研究[14]。

冠状病毒S 蛋白与受体结合后,通过破坏融合前S 蛋白三聚体的稳定性,引起S1 亚基脱落并从S2 亚基过渡到稳定的融合后构象,Arbidol 就通过阻断SARS-CoV-2 刺突蛋白的三聚反应,从而抑制病毒的感染性[15],但其有效性和安全性需要进一步的临床研究。

S2 的两个串联域七肽重复序列1(HR1)和七肽重复序列2(HR2)可形成一个6-HB 的螺旋结构,协助SARS-CoV、MERS-CoV、SARS-CoV-2 与细胞之间膜融合途径[4,16],SARS-CoV-2 的HR1 比SARSCoV 具有更高的螺旋度和热稳定性,与对应的HR2亲和性也更强[17],丹参的亲水化合物丹参酚酸C,通过结合SARS-CoV-2 的HR1 区域中处于融合中间状态的保守疏水囊,阻断HR1 和HR2 之间6-HB 的形成,从而抑制SARS-CoV-2 感染[18]。 通过SARSCoV-2 蛋白HRC 结构域设计出的SARS-CoV-2 HRC脂肽,可通过抑制SARS-CoV-2、SARS-CoV 和MERSCoV 的S 蛋白介导的细胞膜融合,从而有效地抑制病毒感染[19]。

Furin 裂解位点在S 蛋白融合活性中至关重要,有助于病毒合胞体形成, 其抑制剂 CMK 和Naphthofluorescein 在体外可抑制SARS-CoV-2 的复制,该类抑制剂可作为先导化合物,进一步开发为抗病毒药物[20],此外,组织蛋白酶L(CTSL)切割SARS-CoV-2 刺突蛋白,协助病毒进入宿主细胞,有研究表明COVID-19 患者的组织蛋白酶L(CTSL)水平升高,且与疾病的严重程度呈正相关,因此组织蛋白酶L(CTSL)有望开发成为抗SARS-CoV-2 病毒药物的靶标[21]。

2.2 靶向于RNA 依赖性RNA 聚合酶

RNA 依赖性RNA 聚合酶(RdRp,Nsp12)是冠状病毒RTC 的重要组成部分,冠状病毒在复制过程需自身编码的RdRp 参与,主要负责病毒复制过程中链引发和链延伸两个阶段,是研究抗冠状病毒的主要靶标[22]。

瑞德西韦(remdesivir)是一种新型核苷类似物,靶向于RdRp,通过掺入到RNA 复制过程中,添加3个核苷酸从而诱导RdRp 遇到易位屏障,终止链延伸,抑制病毒复制[23],因此瑞德西韦也具有广谱性,对SARS-CoV、MERS-CoV、SARS-CoV-2 均有抗病毒活性[24],临床上瑞德西韦副作用小,多用于治疗呼吸道病毒感染,但对于COVID-19 重症患者没有显著的临床和抗病毒效果[25]。 苏拉明(suramin)在酶水平上,是瑞德西韦的三磷酸活性形式的20 倍以上,通过与RdRp 活性位点结合,抑制病毒RNA 模板与引物和底物结合,同时抑制了RdRp 聚合酶活性[26]。 而利托那韦可与SARS-CoV-2 RdRp 蛋白结合,可能通过抑制RdRp 蛋白3’到5’外切酶活性,可提高药物治疗COVID-19[27]。 利巴韦林多被用于治疗由呼吸道合胞病毒(RSV)引起的呼吸道相关疾病,其在宿主细胞内磷酸化后,可能通过竞争性地抑制病毒的三磷酸鸟苷合成,或是抑制病毒mRNA 合成和抑制RdRp 实现抗病毒作用[28],有研究提出干扰素-α2b 和利巴韦林联合使用可有效减少MERS-CoV、SARS-CoV 的体外复制[29],且能改善被MERS-CoV 感染后恒河猴体内病毒载量和肺组织病理变化[30],对于严重的MERS-CoV 感染患者,干扰素-α2b 和利巴韦林联合治疗可改善14 d 生存率[31]。

2.3 靶向于3C 样蛋白酶

3C 样蛋白酶(3CLpro, Nsp5)负责切割病毒基因组翻译的蛋白前体,是冠状病毒复制的重要酶。3CLpro 在β 属冠状病毒中保守性较高[32],其相关的抑制剂对于MERS-CoV、SARS-CoV 和SARS-CoV-2 有广泛的抗病毒活性[33]。

目前有许多化合物通过靶向3CLpro 显示抗病毒活性,如吲哚-氯吡啉基酯衍生物GRL-0820 和GRL-0920 可与SARS-CoV-2 的3CLpro 共价结合,在体外具有抑制SARS-CoV-2 作用。 GRL-0820 吲哚氮上有一个额外的丙烯取代基,相比之下GRL-0920对SARS-CoV-2 具有更强的抗病毒活性[34]。 针对3CLpro 设计出的TG-0205221 能够减少SARS-CoV和HCoV-229E 病毒滴度,显示出一定的抗病毒活性[35]。 GC-376 和钙蛋白酶抑制剂II、XII 则具有双重作用机制,在Vero 细胞中同时抑制病毒3CLpro和宿主组织蛋白酶L 的活性,对SARS-CoV-2、SARS-CoV、MERS-CoV 以及HCoV-229E、OC43 和NL63 均有抗病毒活性[36]。 阿扎那韦与3CLpro 氢键结合,可抑制SARS-CoV-2 的3CLpro 酶活性,与利托那韦联用还可以下调病毒诱导的IL-6 和TNF-α水平[37]。 洛匹那韦是HIV-1 蛋白酶抑制剂,常与利托那韦联合使用提高血药浓度,其靶向于3CLpro,对冠状病毒有一定的抗病毒活性,预防性给予洛匹那韦/利托那韦可降低MERS-CoV 在小鼠体内病毒载量,治疗性使用可改善肺功能,但不减少病毒复制和严重的肺病理改变[38],早期的洛匹那韦/利托那韦治疗可缩短SARS-CoV-2 病毒在病人体内的排毒时间[39]。

通过体外分子筛查,筛选出槲皮素有望成为靶向于3Clpro 的抗SARS-CoV-2 候选药物[40]。 肉桂硫胺可能通过抑制3Clpro 来抑制SARS-CoV 复制[41]。 表没食子儿茶素- 3 - 没食子酸酯( epigallocatechin-3-gallate, EGCG ) 和 Nsubstited Isatin 可抑制3Clpro,具有作为抗冠状病毒药物的潜力[32,42]。 中药双黄连制剂靶向于SARS-CoV-2 3Clpro,抑制病毒在VERO-E6 细胞中复制,成剂量依赖关系,其活性成分黄芩苷和黄芩素在体外也显示较好抗病毒活性[43]。

3 抗冠状病毒中药的体内研究

传统中药在我国已广泛使用,其成本低,疗效好,能有效缓解症状,减少从轻度到中度或重度的发展,改善治愈率,降低死亡率,促进患者的康复等。 新冠病毒流行期间,以“三药三方”为代表的中药在新冠病毒的防治方面发挥了重大作用[44],基于中药多成分、多靶点、多通路的特点,因此体内模型验证其有效性具有重要意义,由于冠状病毒受体限制,因此中药抗冠状病毒的动物模型评价研究有限。

3.1 甘草干燥根和山茶水提物的小鼠体内抗新冠病毒研究

GB-2 主要由甘草干燥根和山茶通过水提获得,为了研究GB-2 的体内抗SARS-CoV-2 效应,以小鼠为实验动物模型每天口服200 mg/kg 的GB-2。在GB-2 治疗1 周后,小鼠未有死亡,且小鼠活动或体重都没有显著变化。 此外,GB-2 组与对照组比较,血清肌酐、谷氨酸草酰乙酸转氨酶和谷氨酸-丙酮酸转氨酶水平没有显著升高,表明GB-2 没有明显的肾毒性或肝毒性。 肺和肾是ACE2 相对高表达的重要器官,是SARS-CoV-2 的潜在靶点,因此研究了GB-2 对ACE2 和TMPRSS2 蛋白在两个器官组织中的表达影响。 GB-2 治疗1 周(200 mg/kg,口服),肺和肾的免疫组织化学(IHC)数据显示,GB-2组的ACE2 和TMPRSS2 与对照组比较明显减少。结果表明,GB-2 可能阻断ACE2 和ACE2TMPRSS2在肺和肾组织中的表达且无副作用,包括肾毒性和肝毒性[45]。

3.2 通过建立人冠状病毒肺炎疫毒袭肺证小鼠模型,该研究评价热炎宁合剂、复方芩兰口服液、柴银颗粒、金柴抗病毒胶囊的有效性

热炎宁合剂由蒲公英、虎杖、北败酱、半枝莲4味中药组成,结果显示热炎宁合剂能显著降低人冠状病毒肺炎疫毒袭肺证小鼠的肺指数,提高小鼠外周血CD8+T 淋巴细胞和CD4+T 淋巴细胞百分比,其低剂量组(14.67 mL/(kg·d))能提高总B 淋巴细胞百分比,降低小鼠肺组织中人冠状病毒载量和炎症因子TNF-α、IFN-γ、IL-6、IL-10 含量,提示热炎宁合剂对人冠状病毒肺炎疫毒袭肺证具有较好疗效,主要表现在改善肺部病变,增强小鼠免疫机能,降低体内炎症因子等方面[46]。

复方芩兰口服液由金银花、黄芩、连翘、板蓝根4 味中药组成,其高(22 mL/(kg·d))、低剂量(11 mL/(kg·d))可降低人冠状病毒肺炎疫毒袭肺证小鼠的肺指数,抑制率分别为59.01%、47.72%,此外,复方芩兰口服液可降低人冠状病毒肺炎疫毒袭肺证小鼠的肺组织病毒载量,提升其外周血CD4+T淋巴细胞、CD8+T 淋巴细胞及总B 淋巴细胞百分比,降低肺组织中炎症因子IL-6、IL-10、TNF-α 及IFN-γ 表达,明显改善肺组织炎症[47]。

柴银颗粒是由柴葛解肌汤和银翘散化裁,由柴胡、金银花、黄芩、葛根、荆芥、青蒿、连翘、桔梗、苦杏仁、薄荷、鱼腥草11 味中药组成,其高(8.8 g/(kg·d))、低剂量(4.4 g/(kg·d))能降低人冠状病毒肺炎疫毒袭肺证小鼠的肺指数,抑制率分别为61.02%,55.45%,提高小鼠外周血CD4+T 淋巴细胞、CD8+T 淋巴细胞、总B 淋巴细胞百分比,降低小鼠肺组织炎症因子IL-10、TNF-α、IFN-γ 含量[48]。

金柴抗病毒胶囊由金银花、柴胡、连翘、黄芩、清半夏、西洋参、绵马贯众等中药组成,可增加寒湿疫毒袭肺证小鼠的活动度和反应能力,改善小鼠皮毛和大便状态,金柴抗病毒胶囊高(1.76 g/(kg·d))、低剂量组(0.88 g/(kg·d))可以显著降低肺指数,明显提升CD4+T 细胞,CD8+T 细胞,B 细胞含量,低剂量组显著降低血清中MTL 含量,降低肺组织中病毒载量和炎症因子IL-6、IL-10、TNF-α、IFN-γ 表达,改善肺组织病理损伤[49]。

4 结语

新冠病毒感染具有潜伏期长、传染性强等特点,且不断出现变异株,导致传播性增强,免疫逃逸,增加疾病严重性以及降低疫苗的有效性[50]。 目前尚无有效的抗新冠病毒药物批准用于临床,现有药物研究主要集中在病毒相关靶蛋白,由于冠状病毒为RNA 病毒,易发生突变,因此单靶点药物极易产生耐药性。 因此,针对冠状病毒及可能的新出现毒株的药物治疗,应根据其致病特点,深入研究病毒复制周期及病毒-宿主相互作用的特点,不断探索新靶点,将不同靶点药物联合使用降低耐药性及减少毒副作用,此外,“老药新用”及中西医并重的治疗策略都为抗病毒药物研究提供了新思路。