现代医药前沿技术在中药炮制中的应用※

解 杨,钟凌云,王 卓,宋金菊,李家晴

(江西中医药大学,江西 南昌 330004)

中药炮制技术是凝结无数古今中医药学家用药精华的我国独具特色的传统制药技术。在中医药理论指导下,根据药材本身及调剂、制剂、临床需要对药材进行不同的炮制。药物经过炮制后,使本身的药性和功效发生变化,因此在临床应用中根据不同需要选择特定的炮制品,从而发挥药物最大疗效。近年来,随着现代科学技术的发展,中药炮制的研究也逐渐深入。在炮制物质基础方面,大多采用光谱法、色谱法及联用技术;在炮制机制研究方面,通过网络药理学挖掘药物与疾病的共有靶点信息,组学技术结合液相-质谱对血液、尿液等样品进行处理分析,全方位把控药物在生物体中的代谢过程,同时采用分子生物学技术对蛋白质等进行研究。本文以中药炮制物质基础及系统生物学为主线,将新兴的分析技术在中药炮制中的应用进行整理。

1 中药炮制物质基础研究的技术应用

1.1 光谱检测技术 常见的光谱技术包括红外光谱(IR)、紫外光谱(UV)、原子吸收光谱等技术。其中红外光谱可对炮制前后的成分变化进行分析和预测,紫外光谱可对炮制前后含量变化进行定量分析,原子光谱具有较高的灵敏度和较宽的线性范围,适合微量元素的定量分析[1]。

红外光谱的原理是根据分子中的化学键或官能团发生振动吸收,产生不同的吸收频率,以此来鉴别化学物的结构或基团。刘丽军等[2]通过红外光谱比较白芷炮制前后成分变化,结果表明醋制后所有峰的强度均明显减弱,醋制后在3 734 cm-1出现小的吸收峰,在1 647.21 cm-1处发生蓝移。红外光谱除了可以对成分进行定性分析外,还可以定量分析用于指导炮制程度。范晓东[3]利用红外光谱技术得出山茱萸炒制8～12 h所含的羧酸含量最高。

紫外光谱通过测定物质在不同波长的吸光度,计算物质的具体含量。施群等[4]在224 nm下测定何首乌炮制前后总蒽醌的变化,发现炮制后总蒽醌的含量降低,与缓和泻下作用有关,为临床应用提供参考。豨莶草含有的二萜类成分具有抗血栓、降低血小板凝集等药理作用,采用紫外光谱测定总萜类的含量,结果显示炮制后总萜类含量均降低[5]。此外,紫外光谱还多应用于糖类成分的含量测定,其操作快捷,方法简单。李诗慧等[6]比较生竹茹及其姜制、玫瑰制、枳壳制和枳实制不同辅料对多糖的影响,最终发现玫瑰制后竹茹多糖的含量增高明显。

原子吸收光谱法的基本原理是在高温作用下将样品变成原子蒸气,光源灯发射的某一种特征波长与原子蒸气结合,发生光谱吸收反应,不同元素形成的不同光谱图经分析后转为电信号[7],一般在药物分析中多用于检测微量元素。贾敏等[8]通过原子吸收光谱法检测五味子不同炮制品中所含铅、镉、汞、铜、砷的含量,结果发现经过炮制后含量均发生明显变化,且炮制辅料黄酒、蜂蜜和醋中含有的铅和砷超出标准限量,这也反映出辅料的质量标准建立是非常有必要的。

1.2 色谱检测技术 色谱检测分析技术在中药炮制领域的应用越来越多,为炮制品的质量及药性研究提供了新型技术支持。常见的色谱技术包括薄层色谱(TLC)、气相色谱(GC)及高效液相色谱法(HPLC)等,其中HPLC较为常用。

HPLC是以高压下的液体为流动相,采用颗粒极细的高效固定相的柱色谱分离技术。通过HPLC对成分进行研究,以此发现炮制前后药性的变化。有研究将黄连用寒热两种不同类型的辅料进行炮制,结果发现除醋制品外,黄酒、生姜、吴茱萸汁等辛温燥热的辅料炮制出的黄连所含的总生物碱含量高于胆汁、食盐等辅料炮制的黄连,说明药性的变化与炮制辅料及成分变化存在一定相关性[9]。干蟾皮具有清热解毒、利水消肿的功效,主要成分为强心甾类化合物,在干燥过程中分解为有毒成分,采用HPLC检测出砂炒加热炮制后华蟾酥毒基和酯蟾毒配基有不同程度降低,这也说明炮制与药性理论的减毒有一定关联性[10]。此外,在优化炮制工艺研究中,有研究者采用响应面法结合HPLC优化大黄炒制工艺,以帮助确定炮制终点,达到“适中”的效果[11]。

1.3 色谱联用检测技术 色谱技术分离能力强,波谱可对未知化合物进行定性分析,两种技术结合更有利于对成分的分析,因此色谱与光谱或波谱联用已成为中药炮制成分研究的有效手段,如气相色谱-质谱联用技术(GC-MS)联用、液相色谱-质谱联用(LC-MS)等。

GC-MS技术一般用于具有挥发油成分药物的定性定量分析。张霞等[12]采用此技术发现姜制天麻后引入的挥发性成分更稳定,且多为有效成分,对人体有害的成分如1,1-二甲基肼、糠醛等成分较生品含量降低。陈炯等[13]对比吴茱萸用不同辅料炮制后挥发油的变化情况,结果发现生品含量最高,生姜炙、黄连炙次之,甘草炙最低,炮制后毒性成分挥发油的含量及组成均较生品发生变化。

LC-MS技术在中药炮制前后成分差异比较、质量控制等方面发挥着重要的作用[14]。张楠茜等[15]基于LC-MS技术比较加热炮制后鹿茸化学成分的差异,通过主成分分析(PCA)将生品和热炸炮制品明显区分,且热炸后样品较分散,可能是由于热炸过程中温度不同造成成分变化较大。中药药性包括中药的四气五味、升降浮沉、归经及有毒无毒。有研究对比酒炙前后黄芩物质基础的变化,以超高效液相色谱-电喷雾三重四极杆质谱(UPLC-TQMS)进行定量分析,结果发现酒炙黄芩苷等黄酮苷类成分含量下降,黄芩素等黄酮苷元类成分含量有所增加,且黄芩苷、黄芩素、汉黄芩苷、千层纸苷炮制前后含量有显著性差异[16],与黄琪等[17]发现的黄芩酒炙前后药性改变可能与黄酮类成分含量变化有关相一致。

1.4 感官分析检测技术 电子鼻、电子舌是模仿人类嗅觉和味觉感知机制研究的一种现代化智能感官分析检测技术,通过对物体气体和味道的客观化、数字化信息处理,从而实现对中药的质量评价、炮制品鉴定等。利用电子舌、电子鼻检测苦参炮制后气味和味道的差异变化,通过主成分分析(PCA)、聚类分析(HCA)得出米泔水浸泡和蒸制后气味和味道均发生变化,在蒸制6 h后与生品味道有明显差异,得出古代炮制方法与现代方法对比,饮片的气味弱于现代制法的饮片,苦味强于现代制法的饮片,揭示了苦参古今用药理论的内涵[18]。荆文光等[19]从气、味角度寻找姜制后降低厚朴刺激性的原因,结果发现厚朴姜制后涩味降低,电子鼻氮氧化物和硫化物传感器的测定值降低,挥发性成分降低。

2 中药炮制研究的系统生物学技术应用

2.1 网络药理学 网络药理学是融合系统生物学、信息学、计算机科学和药理学的综合学科,基于“药物-靶点-疾病”的思路探索网络各药物节点及疾病的相互关系[20]。传统中医理论对疾病的把控讲究“天人合一”“整体观念”,与网络药理学的思想具有一致性。近年来,在中药炮制的机制研究中也逐渐引入网络药理学的研究思路。

如草乌味辛,有大毒,一般炮制后入药,有研究根据地方民族特色,在现有的«内蒙古蒙成药标准»指导下从整体观阐明诃子解草乌心脏毒性的炮制机制。通过对诃子和草乌两味药的靶点预测及网站搜索心律不齐的相关靶点基因,获得潜在作用靶点,结果发现诃子含有的大量鞣质与草乌中生物碱生成难溶性盐,使草乌毒性成分二萜类生物碱作用强度下降,延缓在体内的吸收,从而缓和毒性,再结合KEGG通路结果可以推测出诃子通过调节心肌细胞进一步发挥保护心脏的作用,减轻草乌的心脏毒性,但后续仍需药理实验验证[21]。

有研究通过网络药理学探索酒蒸黄连-石菖蒲药对的潜在靶点,揭示该药对在糖尿病中的作用机制。通过网络药理学结果,选定胆碱能通路中关键靶点乙酰胆碱酯酶(AchE)建立糖尿病认知功能障碍动物模型,结果发现造模后,在处于高糖高脂状态下,两个关键酶受到显著影响,用药后活性显著降低,进一步说明酒蒸黄连-石菖蒲对糖尿病基因靶点乙酰胆碱(Ach)合成有一定的促进作用,后续可通过增强胆碱能信号通路改善认知功能障碍[22]。胆黄连的炮制以“相资为制”为基本原则,胆汁的加入使黄连生物碱溶出度增加,通过网络药理学分析辅料胆汁的作用,利用其活性成分对特定靶器官进行分析,筛选出 MAPK1、CASP3、ALB、NR3C1潜在核心靶点,提示可能是胆黄连泻肝胆实火的核心靶点[23]。

2.2 组学技术 组学技术常用的有蛋白组学、转录组学、代谢组学、糖组学等,是在现代生物学研究体系中运用高通量分析检测技术的研究方法。通过组学技术,可以从多角度、多方面深入挖掘炮制的作用机制,阐明炮制内涵。

(1)蛋白组学在中药炮制研究中的应用 蛋白组学逐渐成为系统生物学研究的关键部分,一般是指一个基因组所表达的全部蛋白质。通过运用多种手段对生物体内蛋白质的表达进行评估,从而了解复杂的病理过程,包括化学蛋白质组学、定量蛋白质组学和差异蛋白质组学[24]。中药炮制结合蛋白质组学技术在药物炮制品筛选、药效机制的阐释等方面应用广泛,通过比较不同蛋白质的表达差异,以期找到有效的药物成分靶点。

有研究者通过采用Label Free蛋白质组学技术对龟甲及炮制品差异蛋白表达进行分析,结果发现龟甲生品与炮制品相比,有39个差异蛋白,其中23个为特有蛋白,对其差异蛋白进行GO功能和KEGG通路分析,发现GO功能主要涉及氧化还原、单体分解代谢和磷酸核糖代谢等多个代谢过程,对KEGG通路主要涉及HIF-1信号通路、钙通路、阿尔茨海默病等,通过综合富集分析可以为龟甲炮制品的药理活性研究提供参考[25]。杨欣[26]选取不同寒热性中药对肝脏、下丘脑、肝微粒体等组织差异蛋白的变化进行个性与共性比较分析,确定了差异蛋白参与的信号传导通路。

(2)代谢组学在中药炮制研究中的应用 代谢组学是运用液质联用、磁共振等现代技术手段对血液、尿液、粪便等内源性代谢物通过数据处理,对生物体内分子量小于1 000的物质进行定性定量分析的研究技术[27],能够全方位把控生物体内代谢物质群的变化,从而更好地解释中药炮制的机制。

淫羊藿具有补肾壮阳、强筋骨等作用,经过羊脂油炒后药性由寒转温,温肾壮阳作用增强。王玲等[28]从代谢组学角度出发寻找淫羊藿炮制前后对肾阳虚内源性代谢物的变化,结果发现羊脂油通过调节半胱氨酸和蛋氨酸代谢通路,在加热炮制的过程中通过调节甘油磷脂代谢以增强炮制后的疗效。钮敏洁等[29]通过代谢组学技术对酒制前后山茱萸抗肝纤维化作用进行分析,发现炮制品药效作用及回调水平均优于生品,如调节甘油磷酸代谢、视黄醇代谢和花生四烯酸代谢方面效果更佳。有研究运用超高效液相色谱-四极杆飞行时间串联质谱(UPLC-Q-TOF-MS)的非靶向代谢组学测定酒黄芩对急性肺损伤小鼠粪便和血液代谢物水平的影响,以论证«本草蒙筌»中“凡药制造,贵在适中……酒制升提”的内涵。粪便和血浆代谢组学结果显示,酒黄芩干预后主要回调7条代谢通路,其中以对苯丙氨酸和色氨酸的代谢通路作用突出[30]。苯丙氨酸作为人体必需的氨基酸,在急性炎症疾病中发挥着重要作用。色氨酸代谢产物与芳香烃受体结合后,可激活炎症因子,从而有效抑制炎症介质的产生。

炮制生熟异用是指生品饮片炮制为熟制品后,两种饮片具有不同的功效,以此来扩大临床用途,同时达到降低毒性的目的。雷公藤有大毒,毒性主要靶器官为肝脏,在炮制中用甘草调和雷公藤的药性,可降低其肝毒性,结果得出脂肪酸代谢可能是甘草制雷公藤降低肝毒性的重要代谢通路[31]。山楂的不同炮制品临床应用不同,炒山楂善于消食化积,焦山楂常用于消食止泻,山楂炭性涩,长于止血止泻。有研究采用氢核磁共振谱(1HNMR)技术的代谢组学,通过体内药理试验结合代谢组学,结果发现各炮制品均可用于消食导滞,但疗效存在一定差异,其中焦山楂对O-乙酰糖蛋白、谷氨酰胺和甘油磷脂酰胆碱(GPC)的回调水平更趋近于正常,疗效更为显著[32]。

2.3 分子生物学 分子生物学是炮制研究的重要技术之一,在一定程度上能反映检测样本生物体内的蛋白生成、基因活性、表达等过程,可以用于阐明致病及治病机制的重要依据[33]。在研究中一般以酶联免疫吸附测定法(ELISA)、免疫印迹法(Western blotting)、荧光定量PCR等为主。

(1)ELISA在中药炮制研究中的应用 ELISA法是利用抗体与抗原分子结合特点,将游离杂蛋白和固相载体的目的蛋白结合,利用特殊的标记物对其进行定性或定量的一种检测方法。在炮制药效研究方面,通过ELISA测定机体血清或脏器匀浆中不同蛋白的含量,用以说明药物在机体的治疗效果。麦麸为小麦过筛后的种皮,味甘,性平,能和中益脾,缓和药物的燥性。对比蜜麸和麸炒枳壳对大鼠胃肠功能的燥性,用ELISA测定水通道蛋白3(AQP-3)含量及血清环磷酸腺苷(c AMP)/环磷酸鸟苷(c GMP)水平,结果发现蜜麸品对水液代谢及津液损伤最小,分析可能与蜜麸所含蜂蜜炒后补中、调和药性有关[34]。于艳等[35]利用麦麸缓和燥性的特点,对比茅苍术生品及麸炒品对胃溃疡大鼠抗炎的效果,结果发现麸炒可使胃组织中白细胞介素-6、白细胞介素-8及前列腺素E2含量降低,较生品有显著性差别。黄连味苦,性寒,用吴茱萸炮制后可以抑制黄连苦寒药性,让黄连寒而不滞。陈春梅[36]研究发现吴茱萸制后可以在一定程度上降低黄连的寒性,缓和黄连生品对交感神经系统的抑制作用。

(2)免疫印迹法在中药炮制研究中的应用 免疫印迹法是将混合抗原样本在凝胶板上进行电泳分离,然后取固定化基质膜与凝胶相贴。在印迹纸的外力作用下,使凝胶中的单一抗原组分转移到印迹纸上,并且固相化。最后应用免疫覆盖液技术如免疫同位素探针或免疫酶探针等,对抗原固定化基质膜进行检测和分析[37]。附子作为温阳药的代表药,具有回阳救逆、补火助阳等功效,属于温热药物,能促进生物体的能量代谢。建昌帮特色炮制饮片阴附片和阳附片由于炮制方法独特,备受关注。棕色脂肪组织参与能量代谢,对生物体的体温和能量代谢起到重要的作用。凡若楠[38]利用免疫印迹法对特异性蛋白解偶联蛋白-1(UCP1)进行研究,结果发现阳附片能使UCP1表达水平显著升高,阴附片也可促进UCP1表达。有研究对桑螵蛸生品及炮制品抗氧化作用进行研究,结果发现桑螵蛸各组超氧化物歧化酶(SOD)蛋白表达水平均较模型组有显著性差异,其中生品效果更优,这可能是其所含抗氧化成分为酚类物质,经过加热处理后含量降低有关[39]。

(3)荧光定量PCR在中药炮制研究中的应用 荧光定量PCR技术是指在PCR反应体系中加入荧光基团,利用荧光信号累积实时监测整个PCR进程,最后通过统计学对未知模板进行定量分析[40]。刘芬[41]通过RT-PCR技术对湿阻中焦证模型空肠组织血管活性肠肽受体2(IPR2)和胃窦部MTLR基因进行分析,结果发现苍术麸炒后苍术素含量增加,能明显纠正VIPR2、MTLR基因的表达水平。藤黄生品有大毒,有研究对胃肠道中AQP3、AQP4的m RNA表达进行分析,结果发现藤黄炮制后可降低AQP3和AQP4的表达,且与剂量呈正相关[42]。

3 展望

本文从物质基础及系统生物学两个方面为切入点介绍了新兴的分析技术,如在炮制的物质基础研究方面,整理了光谱、色谱及色谱联用技术;在系统生物学研究方面,介绍了网络药理学、组学技术及分子生物学等技术在中药炮制研究中的应用,但在整理过程中也发现新技术在中药炮制应用中存在的一些问题。

在物质基础研究方面,采用的分析技术大多单一。中药成分复杂,在炮制过程中成分差异更大,仅以1种分析技术去检测,结果不够科学严谨。此外,数据处理的方法过于简单,如红外光谱仅通过肉眼得到一些峰位和结构,紫外光谱法仅通过吸光度测定总成分的含量,准确度、专属性均不高,可进一步整合生物信息学技术,挖掘更多的潜在信息[1]。在系统生物学研究方面,网络药理学已经广泛应用于中药研究的始动预判中,但研究质量参差不齐,如一些中药、疾病数据库更新慢,信息来源单一等。此外,中药方剂组方因其在使用中的剂量及炮制方法不同而疗效不同,而网络药理学在对成分筛选的过程中,仅根据口服利用度或药代动力学等相关指标进行筛选,对中药成分的量效关系考虑不周。在组学技术研究中,大多是单一组学技术的运用,应多组学结合,更全面地阐明药物对生物体的影响过程。

中药炮制学是我国制药技术的瑰宝,要运用新的现代分析技术对炮制的成分及炮制机制进行更深入的挖掘,充分借鉴其他学科的新理论、新方法,将对中药炮制的研究提升到更高的水平。