Notch信号通路在骨肉瘤增殖、耐药、上皮-间质转化中的作用机制

侯伟岩，曹云鹏， 孔令伟，纪海茹

骨肉瘤是一种原发性恶性肿瘤，发病率高、增长幅度快，多见于儿童和青少年。骨肉瘤好发于血运丰富、生长迅速的骨骺区[1]。原发性骨肉瘤早期易发生血行转移[2]，肺是其最常见的转移器官[3]。目前，综合治疗模式虽然使患者生存率有了一定的提高，而早期肺转移依然导致患者预后较差。

Notch信号通路高度保守，在肿瘤的发生、发展中起关键作用，参与肿瘤的增殖、浸润转移、血管生成、多药耐药等多种生物学行为，且调控机制较为复杂。其与肿瘤发生、发展的关系已成为近期研究的热点，深入剖析Notch信号通路在骨肉瘤中的作用机制，可给予其临床治疗方式的研究以新启发。本文现对Notch信号通路与骨肉瘤的关系作一综述。

1 Notch信号通路

Notch基因最早于1919年被提出，而Notch信号通路与骨肉瘤的研究始于2004年[4]，其与其他肿瘤细胞信号通路的不同之处在于具有抑癌和(或)致癌的双重性，具体表现由Notch通路的强度、表达时机及细胞种类的不同来决定[5]。Notch信号通路包括4个受体(Notch1/2/3/4)、5个配体(DLL1/3/4、JAG1/2)和细胞内效应分子[6]。Notch信号通路激活以其受体与邻近细胞上所表达的同源配体结合为起始，通过两次蛋白酶水解切割后形成Notch细胞内结构域NICD。NICD由细胞质膜释放并转移到细胞核，在核内与RBPJ结合，达到使下游转录因子活化表达的目的[7]。

2 Notch信号通路与骨肉瘤细胞增殖

Notch信号通路可促进骨肉瘤细胞增殖，当Notch信号通路被阻断时可使骨肉瘤细胞的增殖受到抑制。在体外实验中，Engin等[8]通过对3例经治疗和7例未经任何治疗处理的骨肉瘤患者活检标本进行检测对比后，发现受体Notch1、配体Jagged1、靶基因Hes1、Hey2的表达均较野生型成骨细胞明显增加，且在经DAPT阻断Notch信号通路后，骨肉瘤细胞增殖均受抑制；在体内实验中，Qin等[9]通过构造骨肉瘤K7M2细胞系的小鼠胫旁肿瘤模型和肺转移模型，进一步证明DAPT可通过抑制Notch激活来抑制Erk通路磷酸化，以有效抑制肿瘤生长、血管生成和肺转移，进而提高患者生存率；Li等[10-11]通过对二烯丙基三硫化物(DATS)和姜黄素在骨肉瘤中的作用进行深入探究，发现大部分骨肉瘤细胞系中均有Notch1/2/3基因信号存在，且在Notch1与下游基因表达下调时，骨肉瘤细胞的增殖和转移被抑制。

2.1 γ-分泌酶抑制剂阻断Notch通路与骨肉瘤细胞增殖Notch信号通路的激活需要经过3次酶切过程，第3次酶切过程位于S3酶切位点，由Notch通路中的关键酶γ-分泌酶进行[12]，而γ-分泌酶抑制剂(GSI)可阻止该酶合成，从而使Notch通路不被激活。DAPT作为一种常见的人工合成GSI，对γ-分泌酶的阻断作用具有特异性，可以阻止Notch信号通路的激活[13]。

游浩等[14]用不同浓度DAPT处理体外培养的MG-63骨肉瘤细胞，发现当Notch信号被阻断时MG-63细胞增殖受限，并呈剂量、时间依赖性；实验还发现，Notch1及其下游靶基因HES1的表达均下调，提示DAPT抑制MG-63细胞的增殖可能与Notch1、HES1下调有关。

2.2 Notch配体Jagged1与骨肉瘤细胞增殖肿瘤细胞的异常增殖与其细胞周期调控紊乱密切相关，Notch信号通路参与多种肿瘤的细胞周期调控，Jagged1作为Notch的重要配体，是Notch信号通路激活不可或缺的部分，其与Notch1受体的结合可促进Notch信号通路的激活，在肿瘤细胞周期调控过程中发挥重要作用[15]。Chen等[16]发现高表达lncRNA MEG3的骨肉瘤细胞可显著降低Jagged1与Notch1的表达水平，细胞增殖受限。Lu等[17]发现miR-26a可直接抑制Jagged1配体，进而减少Notch信号通路激活来抵抗骨肉瘤的增殖。

3 Notch信号通路与骨肉瘤多药耐药

多药耐药是导致肿瘤化疗失败的主要原因，可能的机制包括肿瘤干细胞存活、药物外排增加、药物靶标突变、DNA损伤修复、替代信号激活及细胞凋亡逃逸等[18]。Notch信号通路可通过减少细胞内药物积累、调控上皮-间质转化(epithelial-mesenchymal transition, EMT)、导致microRNA失调和细胞凋亡基因的紊乱、调节肿瘤干细胞等方面，影响肿瘤的耐药性[19]。以Notch信号通路为中心开展对骨肉瘤多药耐药的研究，探寻逆转耐药治疗的手段，增强骨肉瘤对化疗药物的敏感性，对提高骨肉瘤患者的生存率具有重要的临床意义。

3.1 骨肉瘤顺铂耐药与Notch信号通路顺铂作为经典铂类药物，最早于1970年引入骨肉瘤治疗中，并已成为多种恶性肿瘤的一线化疗药物，其抑制肿瘤生长与Notch信号通路有关。刘盖为等[20]用不同浓度的顺铂(2、4、6、8、10 μmol/L)处理骨肉瘤143B细胞(1、2、3、4、5天)后，发现低浓度顺铂(≤4 μmol/L)处理48 h后会激活Notch信号通路，而高浓度顺铂(≥6 μmol/L且<8 μmol/L)处理48 h后会通过抑制Notch信号通路来抑制骨肉瘤生长，由此可见，顺铂对Notch信号通路的影响呈剂量和时间依赖性。也有研究证明，Notch目的基因的表达与化疗敏感性呈负相关，即上调Notch信号通路可增强癌细胞的耐药性[21]，因此可在适当范围内提高化疗药物的浓度来降低骨肉瘤细胞的耐药性，起到更有效的治疗效果。

骨肉瘤顺铂耐药并非一成不变，其耐药状态可逆，给予骨肉瘤顺铂耐药细胞一个“药物假期”，即停止用药一段时间后发现Notch通路等因子的表达水平较骨肉瘤顺铂耐药组明显下降，说明药物中断可使骨肉瘤顺铂耐药细胞再敏化，提示可通过间歇化疗保证骨肉瘤细胞对顺铂等化疗药物的敏感性[22]。

3.2 骨肉瘤干细胞阿霉素耐药与Notch信号通路阿霉素作为一种有效的一线抗肿瘤药物，对实体肿瘤有着广泛的活性谱[23]。阿霉素耐药也是影响骨肉瘤疗效及预后的重要因素。余玲等[24]证实骨肉瘤细胞具有阿霉素耐药性，化疗可富集骨肉瘤干细胞，他们发现耐阿霉素骨肉瘤干细胞中Notch受体胞内段NICD1及靶基因表达量上调，说明Notch通路可富集阿霉素诱导的骨肉瘤干细胞；Notch通路被阻断后，骨肉瘤细胞对阿霉素的敏感性提高，提示可通过抑制Notch通路提高阿霉素靶向杀伤骨肉瘤细胞的能力。

张义等[25]证实，沉默MG-63阿霉素耐药株中lncRNA FOXC2-AS1的表达可阻断Notch1通路的激活，提高对阿霉素的敏感性，逆转骨肉瘤细胞对阿霉素的耐药。

3.3 骨肉瘤乏氧与Notch信号通路乏氧微环境是肿瘤耐药的重要因素，顺铂等临床常用化疗药物在乏氧状态下MG-63骨肉瘤细胞的半数抑制浓度IC50显著高于常氧状态[26]。乏氧与Notch信号通路存在相互作用关系，乏氧状态下Notch-ICN、MRP1等蛋白的表达水平均较常氧状态下显著升高，表明MG-63细胞内Notch信号通路被激活，利用siRNA干扰乏氧状态下的Notch1后，MG-63细胞耐药性明显下降[27]。王淼等[28]发现，乏氧微环境与常氧环境相比，可明显促进MG-63细胞的增殖、转移与Notch信号通路相关蛋白HIF-1α、Notch1、Hes-1的表达；而在乏氧状态下加入Notch1通路抑制剂DAPT后，MG-63细胞株的增殖与侵袭能力均较单独乏氧条件下得到有效抑制，因此通过阻断Notch1表达可改善骨肉瘤细胞在乏氧状态下的多药耐药。

3.4 骨肉瘤内耐药因子与Notch信号通路减少细胞内的药物积累是调节肿瘤耐药的一条重要途径，ATP-结合盒转运蛋白(ATP-binding cassette, ABC)介导的药物外排与骨肉瘤多药耐药相关，MDR相关蛋白-1(MDR related protein-1, MRP1)(又名ABCC1)是ABC的主要靶点[29]。ABCC1高表达的骨肉瘤耐药细胞内NICD和PSEN1(一种γ-分泌酶的催化剂，参与细胞内Notch1蛋白的合成)的表达显著增加，Notch通路激活后，可促使NICD/CBF1复合物形成，进而降低ABCC1表达，从而使骨肉瘤细胞的药敏性增强[30]。这也证明了上文中所提到的Notch1在乏氧状态下参与骨肉瘤的多药耐药，其发生机制可能与MRP1等蛋白的表达水平提高有关的结论。

BCL蛋白家族由促凋亡蛋白(Bax、Bak和Bad)和抗凋亡蛋白(BCL-2和BCL-xL)组成，具有调节细胞周期的作用。通过慢病毒体外敲除BCL-2基因可显著增强骨肉瘤细胞对化疗药物的敏感性；反之，敲除Bax基因可降低骨肉瘤细胞的化疗敏感性[31]。吴德明等[32]通过用mNotch-1 shRNA干扰骨肉瘤细胞后，可有效地使BCL-2蛋白表达降低，Bax蛋白表达升高，从而诱导骨肉瘤细胞的凋亡。Ye等[33]通过在其他肿瘤中沉默Notch1表达也得到了相似结果，并证实了Notch信号通路与BCL-2和Bax共同参与肿瘤化疗敏感性的调节。

p53是目前被研究最为透彻的抑癌基因，被认为是细胞基因组的看家基因，与生长停滞、衰老、细胞凋亡和DNA修复等多种生物学行为关系密切。先天性p53基因失活所引起的Li-Fraumeni综合征患者的骨肉瘤发病风险要远比p53基因正常人群高[34]。突变型p53基因可通过上调促凋亡基因p21和Bax增加骨肉瘤耐药细胞对化疗药物的敏感性[35]。p53基因靶向激活Notch1信号通路，进而通过Notch/Hes相关阻遏蛋白转录途径抑制促凋亡基因叉头框蛋白O3(forkheadbox O3, FOXO3)，抵抗由顺铂诱导的DNA损伤，抑制肿瘤细胞凋亡[36]，从而产生多药耐药。

4 Notch信号通路与EMT

癌症致死的重要原因是肿瘤转移，而EMT是肿瘤侵袭转移的关键过程，EMT可使上皮细胞失去极性成为间充质细胞，获得迁移能力，侵袭周围组织。E-钙黏蛋白属于细胞间的黏附因子，参与EMT的产生，该蛋白表达水平的下调会使细胞间黏附能力降低，促进细胞转移[37]。有研究证明，在众多肿瘤的早期转移中，EMT发挥重要作用，提示可研究如何抑制肿瘤细胞的EMT，起到抑制肿瘤转移的作用，以提高癌症患者的生存率。

Su等[38]通过小干扰敲低ATG4A在骨肉瘤中的表达水平，发现Notch1、Hes1表达均下调，E-钙黏蛋白表达上调，证明了ATG4A可通过激活Notch信号通路促进骨肉瘤的EMT。

诱导启动EMT的方式有多种，如乏氧可通过活化Notch通路的方式来促进EMT、Notch配体与受体的结合激活Notch通路产生EMT、Notch1受体高表达诱导EMT的发生等。陈敬腾等[39]在体内外实验中敲除转录因子Slug后，可逆转Notch通路诱导的EMT，进而减弱骨肉瘤的转移侵袭能力。

5 结语

Notch信号通路在胚胎发育、稳态维持、机体免疫调控及肿瘤等疾病的诱发产生过程中发挥着不可或缺的重要作用。在Notch信号通路对治疗恶性肿瘤所具有的广阔前景下，Notch信号通路已成为研究热点。但有文献报道[40]，在哺乳动物某些细胞中存在与RBPJ无关的信号，可使NICD与细胞质蛋白或核转录因子直接相互作用，这种Notch非典型信号通路在骨肉瘤中的作用研究甚少，可能会成为未来的一个研究方向。在对Notch信号通路与骨肉瘤的关系研究中，不同学者仍持有不同观点，但我们坚信随着对Notch信号通路研究的不断深入，其具体作用机制将会被阐明，为Notch通路在骨肉瘤的临床诊疗及预后提供理论依据。