补肺活血胶囊UPLC指纹图谱建立及质量评价△

任慧，郭盛*，许小雪，张祎盈，李全，王恒斌，耿婉丽，尚尔鑫，钱大玮*，段金廒

1.南京中医药大学 中药资源产业化与方剂创新药物国家地方联合工程研究中心/江苏省中药资源产业化过程协同创新中心/江苏省方剂高技术研究重点实验室，江苏 南京 210023；

2.雷允上药业集团有限公司，江苏 苏州 215003；

3.广东雷允上药业有限公司，广东 云浮 527300

补肺活血胶囊收载于《中华人民共和国药典》（以下简称《中国药典》）2020 年版，具有益气活血、补肺固肾功效，用于肺心病（缓解期）属气虚血瘀症的治疗[1]。药理研究显示，补肺活血胶囊可有效改善肺通气功能[2-3]，缓解由慢性阻塞性肺疾病（COPD）所致的咳喘胸闷、心悸气短等症状。近期研究表明，补肺活血胶囊可用于新型冠状病毒肺炎（COVID-19）患者康复期治疗，可促进COVID-19康复期患者肺部病灶的吸收，防止肺部感染的恶化，同时增加康复期患者运动耐量，提高机体健康水平[4-6]。目前，补肺活血胶囊已列入《中成药防治新型冠状病毒肺炎专家共识》，并受到世界卫生组织（WHO）的关注。

补肺活血胶囊由黄芪、赤芍、补骨脂3 味中药组成，所含化学成分种类丰富[7-9]，如黄酮类、皂苷类、萜类、鞣质类、香豆素类等，但《中国药典》2020 年版中关于补肺活血胶囊的质量标准仅对组方中黄芪含有的黄芪甲苷、赤芍中含有的芍药苷、补骨脂中含有的补骨脂素及异补骨脂素作出了明确要求，指标成分较单一，无法全面评价药品整体质量。中药指纹图谱是一种依赖于不同提取方法所得的活性成分半定量鉴别技术[10]，强调对图谱共有峰的归属及相似度评价，可较为全面、系统地评价中药复方制剂的质量稳定性。为了更好地评价补肺活血胶囊的整体质量，本研究在相关研究基础上[11-12]，采用超高效液相色谱法（UPLC）优化建立了补肺活血胶囊指纹图谱，缩短了仪器运行时间，提高了检测效率。此外，通过UPLC 串联四级杆飞行时间质谱仪（UPLC-Q-TOF-MS）对指纹图谱中20 个共有峰进行了分析鉴定，并采用主成分分析（PCA）对20 个共有成分中批间差异较大的成分进行筛选，以期全面评价补肺活血胶囊整体质量，为产品质量均一性及临床安全用药提供参考。

1 材料

1.1 仪器

ACQUITY-UPLC 型超高效液相色谱仪、光二极管阵列检测器（PDA）、Synapt™ Q-TOF 质谱仪［含Lock-spay 接口、电喷雾离子源（ESI）、MassLynx™型质谱工作站，Waters公司］；Milli-Q型超纯水制备仪（Millipore 公司）；KQ-250E 型超声波清洗器（昆山禾创超声仪器有限公司）；MS105 型、ML204 型电子分析天平（Mettler-Toledo 公司）；AnkeGL-16 GⅡ型离心机（上海安亭科学仪器厂）；WH-微型涡旋混合仪（上海沪西分析仪器厂有限公司）。

1.2 试药

对照品氧化芍药苷（批号：Z14J9S63652）、芍药内酯苷（批号：Y15D8H50784）、补骨脂苷（批号：Y07A7S12664）、芍药苷（批号：X12A8C33672）、异补骨脂苷（批号：Y27A9S60238）、毛蕊异黄酮苷（批号：Y27F9H54731）、没食子酰芍药苷（批号：P08A10S85131）、芒柄花苷（批号：R28O8F46957）、毛蕊异黄酮（批号：Y24N9Y75652）、补骨脂素（批号：C22A9Q68562）、异补骨脂素（批号：C05M10Q82078）、苯甲酰芍药苷（批号：P02D7F26004）、芒柄花素（批号：F27J7S18516）均购自上海源叶生物科技有限公司，纯度均≥98%；甲醇、乙腈、甲酸均为色谱纯；超纯水为实验室自制。

对照药材黄芪（批号：120974-201813）、赤芍（批号：121093-201804）、补骨脂（批号：121056-201605）均购自中国食品药品检定研究院，经南京中医药大学江苏省中药资源产业化过程协同创新中心段金廒教授鉴定，均符合《中国药典》2020 年版各项要求。11 批补肺活血胶囊均由广东雷允上药业有限公司提供，批号分别为012001（S1）、012007（S2）、012048（S3）、012049（S4）、012053（S5）、012054（S6）、012112（S7）、022004（S8）、022014（S9）、022102（S10）、202007（S11）。

2 方法与结果

2.1 色谱条件

采用Acquity UPLC BEH C18色谱柱（100 mm×2.1 mm，1.7 μm)，以乙腈（A）-0.1%甲酸水溶液（B）为流动相，梯度洗脱（0～1 min，5%A；1～5 min，5%～12%A；5～8 min，12%A；8～14 min，12%～30%A；14～17 min，30%～45%A；17～18 min，45%～85%A；18～20 min，85%A）；检测波长为246 nm；流速为0.4 mL·min-1；柱温为35 ℃；进样量为4 μL。

2.2 质谱条件

采用ESI，正、负离子模式下分别扫描；锥孔电压：40 V；毛细管电压：4 kV；脱溶剂气温度：400 ℃；离子源温度：150 ℃；脱溶剂气流量：500 L·h-1；锥孔气流量：50 L·h-1；碰撞能量：10～40 eV；质量扫描范围：m/z100～1000；准确质量测定采用亮氨酸-脑啡肽（ESI+：m/z556.277 1,ESI-：m/z555.261 5）溶液为锁定质量溶液。

2.3 溶液的制备

2.3.1 混合对照品溶液的制备 称取氧化芍药苷、芍药内酯苷、补骨脂苷、芍药苷、异补骨脂苷、毛蕊异黄酮苷、没食子酰芍药苷、芒柄花苷、毛蕊异黄酮、补骨脂素、异补骨脂素、苯甲酰芍药苷、芒柄花素对照品适量，精密称定，加甲醇溶解，定容，配制成一定质量浓度的对照品储备液。分别精密吸取对照品储备液适量，以50%甲醇稀释，定容，制成氧化芍药苷、芍药内酯苷、补骨脂苷、芍药苷、异补骨脂苷、毛蕊异黄酮苷、没食子酰芍药苷、芒柄花苷、毛蕊异黄酮、补骨脂素、异补骨脂素、苯甲酰芍药苷、芒柄花素质量浓度分别为2.144、4.440、1.560、4.040、2.680、1.312、2.032、1.744、1.640、3.672、3.616、2.364、2.280 μg·mL-1的混合对照品溶液。

2.3.2 供试品及单味药溶液的制备 精密称取补肺活血胶囊内容物粉末0.5 g，置于50 mL 具塞锥形瓶中，加入50%甲醇25 mL，称质量，超声处理1 h（400 W，40 kHz），温度为50 ℃，放至室温，称质量，以50%甲醇补足减失的质量，摇匀，0.22 μm微孔滤膜滤过，取续滤液，即得供试品溶液。取黄芪、赤芍、补骨脂单味对照药材适量，按上述供试品溶液制备方法制备各单味药供试品溶液。

2.4 方法学考察

2.4.1 精密度试验 取补肺活血胶囊（S1）供试品溶液连续进样测定6 次，记录色谱图。其中补骨脂素出峰时间适中，与其他成分分离度良好，峰面积较大，因此选择补骨脂素（峰14）为参照峰，分别计算各共有峰的相对保留时间和相对峰面积，分别计算其RSD。结果显示，连续进样测定6 次各共有峰的相对保留时间RSD 均小于0.08%，相对峰面积的RSD均小于1.42%，表明该仪器精密度良好。

2.4.2 稳定性试验 取用于精密度试验的补肺活血胶囊供试品溶液，分别于室温下放置0、2、4、8、12、24 h 后进样测定，记录色谱图。以补骨脂素（峰14）作为参照峰，分别计算各共有峰的相对保留时间和相对峰面积，分别计算其RSD。结果显示，24 h 内进样分析的色谱图各共有峰相对保留时间RSD 均小于0.18%，相对峰面积RSD 均小于2.31%，表明室温条件下供试品溶液在24 h内稳定。

2.4.3 重复性试验 取补肺活血胶囊（S1），平行6 份，分别制备供试品溶液，进样测定，记录色谱图。以补骨脂素（峰14）作为参照峰，分别计算各共有峰的相对保留时间和相对峰面积，分别计算其RSD。结果显示，各共有峰相对保留时间的RSD 均小于0.12%，相对峰面积的RSD 均小于1.76%，表明该方法重复性较好。

2.4.4 指纹图谱建立 取11 批供试品（S1～S11），分别制备供试品溶液并进样测定，分别记录色谱图，将色谱图导入“中药色谱指纹图谱相似度评价系统”（2012 版）。截取1～20 min 色谱图进行分析，选取S1样品色谱图为参照（参照图谱生成方法：中位数法，时间窗宽度：0.2），多点校正后进行自动匹配分析，标定共有峰，计算相似度[13]。11 批补肺活血胶囊样品的UPLC 指纹图谱叠加图及对照图谱见图1，共有20个共有峰被标定。S1～S11号样品的指纹图谱与对照图谱的相似度分别为0.969、0.998、0.982、0.996、0.997、0.997、0.990、0.985、0.998、0.996、0.987，均≥0.969，表明各批次间补肺活血胶囊质量均一稳定。

图1 11批补肺活血胶囊的UPLC叠加图谱和对照指纹图谱

2.5 共有峰的定性分析

采用UPLC-Q-TOF-MS 对11 批补肺活血胶囊中的20 个共有峰进行定性分析。取供试品溶液及混合对照品溶液，按2.1项下色谱条件和2.2项下质谱条件进行正、负离子扫描并采集数据，得到总离子流色谱图（图2）。由对照品保留时间和质谱信息，结合相关文献数据比对[14-17]，进行化学成分确认，共鉴定了其中18个共有峰的化学成分信息，其中13个成分经对照品比对确认，另有5个成分为依据质谱裂解信息推测，具体结果见表1。

表1 补肺活血胶囊样品中20个共有峰UPLC-Q-TOF-MS质谱数据

图2 补肺活血胶囊供试品溶液与混合对照品溶液UPLC-Q-TOF-MS总离子流图

2.6 共有峰的归属

取供试样品、混合对照品及单味药供试品溶液，按2.1 项下色谱条件分别进样测定，记录色谱图（图3）。根据混合对照品各色谱峰保留时间并结合紫外光谱，指认出其中13 个色谱峰，分别为氧化芍药苷（3号峰）、芍药内酯苷（4号峰）、补骨脂苷（5号峰）、芍药苷（6号峰）、异补骨脂苷（7号峰）、毛蕊异黄酮苷（10号峰）、没食子酰芍药苷（11号峰）、芒柄花苷（12号峰）、毛蕊异黄酮（13号峰）、补骨脂素（14号峰）、异补骨脂素（15号峰）、苯甲酰芍药苷（16号峰）、芒柄花素（18号峰）。将供试品溶液、混合对照品溶液、黄芪单味药材溶液、赤芍单味药材溶液及补骨脂单味药材溶液色谱图比对分析，结果显示峰10、12、13、18 归属于黄芪药材，峰1、3、4、6、9、11、16 归属于赤芍药材，峰2、5、7、8、14、15、17、19、20 归属于补骨脂药材。

图3 补肺活血胶囊供试品溶液、混合对照品溶液及各单味药材溶液的UPLC图

2.7 PCA

补肺活血胶囊指纹图谱相似度结果表明，11批样品相似度较高、质量均一性较好，但不同批次间成分峰面积仍存在差异。为进一步分析造成这种偏差的原因，本研究采用SIMCA 14.1 软件，以20 个共有峰峰面积为变量进行PCA 及样品和变量载荷图绘制（图4）。结果显示，2 个主成分方差贡献率分别为74.4%、14.2%，累积方差贡献率达88.6%，提示其可较好地代表补肺活血胶囊的成分信息和特征。图4A 显示，11 批样品虽均位于95%置信区间内，但在横坐标（主成分1）方向批间离散程度较大。图4B显示，补骨脂苷（5号峰）、异补骨脂苷（7号峰）在主成分1上偏离程度较大，没食子酸（1号峰）、芍药内酯苷（4号峰）、芍药苷（6号峰）、鞣花酸（9号峰）、补骨脂素（14号峰）及异补骨脂素（15号峰）在主成分2上差别较大，提示上述8个成分对批间差异影响较大，其中尤以补骨脂苷（5号峰）和异补骨脂苷（7号峰）差异贡献较大，提示其为影响补肺活血胶囊批间质量均一性的主要指标成分。

图4 11批补肺活血胶囊的PCA得分图与变量载荷图

3 讨论

中药复方制剂的质量均一、稳定，是保证其临床安全有效的前提。但由于多数中药复方制剂组方药味多样、所含成分类型复杂，目前质量控制标准中仅针对其含量较高的组分进行质量均一性控制已很难满足临床需求。针对该问题，已有报道建议增加补肺活血胶囊质量控制成分数量。例如，唐清等[11]采用HPLC 建立了补肺活血胶囊指纹图谱，液相运行时间为65 min，确定了12 个共有峰，指认了8个成分；舒婷等[12]同样采用HPLC建立了补肺活血胶囊指纹图谱，液相运行时间为60 min，确定了18个共有峰，并对其中5 个共有成分进行了含量测定。但上述方法均存在运行耗时长、标定共有峰数量有限、未分析影响其均一性的关键组分等不足。因此，有必要在前人工作的基础上优化建立用于补肺活血胶囊质量控制的快速分析方法，并筛选发现影响批间质量均一稳定的关键化学组分，以提高其临床用药的安全性与有效性。

在建立补肺活血胶囊指纹图谱过程中，本研究首先考察了提取溶剂（水、25%甲醇、50%甲醇、75%甲醇、甲醇、50%乙醇）、提取方式（回流、超声）、提取时间（20、40、60、80 min）对补肺活血胶囊成分提取转移率的影响。结果表明，甲醇提取效果优于乙醇，以50%甲醇作为提取溶剂时，色谱峰数量较多。回流提取与超声提取对成分提取的差异影响较小，超声提取时间在60 min 时最优，故本研究最终选择50%甲醇超声提取60 min 为供试样品溶液的制备方法。

中药复方制剂成分繁杂，各类型化合物紫外吸收波长差异较大，本研究通过PDA 全波段（190～400 nm）扫描，比较不同波长下，各色谱峰形情况，结果显示，检测波长为246 nm 时，补肺活血胶囊各色谱峰峰形较好、基线平稳、相邻色谱峰分离度较高，多数成分色谱信息得以体现。虽黄芪中黄芪甲苷等皂苷类成分存在末端吸收难以检测到的问题，但其黄酮类成分毛蕊异黄酮、芒柄花素等色谱信息均可体现，故本研究选用246 nm 作为补肺活血胶囊指纹图谱检测波长。

本研究采用UPLC 建立了20 min 分离时间内含有20 个共有峰的指纹图谱分析方法，可在较短时间内较为全面地反映补肺活血胶囊中化学成分信息，且11 批供试样品指纹图谱相似度较高，表明其可用于该厂家生产的补肺活血胶囊产品的质量控制。PCA 显示，补骨脂苷和异补骨脂苷为影响补肺活血胶囊批间质量均一性的潜在化学成分。因此，建议在本研究所建立的指纹图谱分析方法的基础上，可增加上述香豆素类化学组分的含量测定，共同用于补肺活血胶囊的质量均一性控制，以保证其临床应用的安全性和有效性。