基于网络药理学探究黄精防治阿尔茨海默病作用机制

朱徐东，黄丽萍，朱娜，王松，姚伟，吴毅

1.江西省药品检验检测研究院，国家药品监督管理局中成药质量评价重点实验室，江西省药品与医疗器械质量工程技术研究中心，江西 南昌 330029；2.江西中医药大学，江西 南昌 330004

阿尔茨海默病（Alzheimer's disease，AD）是一种以记忆力减退、认知功能障碍、行为能力异常为临床特征的神经退行性疾病。目前对阿尔茨海默病的发病机制有一些假说，包括基因突变学说（β-淀粉样蛋白异常沉积、Tau 蛋白过度磷酸化与ApoE 基因异常表达），神经递质学说，神经炎症学说等［1］。中药材中一些有效成分（如苷类、黄酮类、生物碱类、多糖类等）对防治AD 有一定的疗效并且毒性小［2］。

黄精，属于百合科黄精属多年生草本植物的干燥根状茎，是一种药食同源性中药，具有补气养阴、润肺、补脾、益肾等功效，也具有防治阿尔茨海默病、改善学习记忆能力、提高免疫力等药理作用。黄精含有多糖、黄酮、木脂素、生物碱、皂苷等化学成分，这些成分使其具有多种药理活性。有研究显示黄精可通过增强α7nAChR 的表达［3］、减少海马组织中Aβ 沉积［4］改善AD 模型大鼠的学习记忆能力。

网络药理学方法是基于系统生物学理论，对生物系统的网络分析。网络药理学强调对信号通路的多途径调节，与中药多成分、多靶点、多途径的防治原理相符合。本文采用网络药理学方法探讨黄精防治AD 的可能作用机制，以期能为黄精的深入研究提供依据。

1 材料与方法

1.1 黄精化合物的获取和筛选

通过TCMSP 数据库（中药系统药理学分析http://tcmspw.com/tcmsp.php）、查阅相关文献［5-10］以及课题组从炆黄精中分离得到的24 个化合物(纯度＞90%)［11-12］获取黄精的化学成分。为了便于分析，将黄精中的化合物命名为HJ001、HJ002 等。通过Chemdraw 软件将收集到的化合物转化为sdf 文件格式，导入Swiss ADME（http://www.swissadme.ch/）平台，对收集到的化合物进行筛选。

1.2 活性成分靶点预测

将活性成分的sdf 文件导入Swiss Target Prediction（http://www.swisstargetprediction.ch/）平台，设置属性为“homo sapiens”，预测活性成分的潜在靶点，删除重复值得到活性成分靶点。

1.3 AD 疾病相关基因的筛选

以“Alzheimer's disease”为关键词，从Genecards（http://www.genecards.org/）、OMIM（http://www.omim.org/）、Drugbank（http://go.drugbank.com）三个疾病靶点数据库搜集AD 有关的基因，合并三个疾病数据库靶点后，删除重复值得到AD 相关靶点。

1.4 黄精防治AD 成分-靶点PPI 网络构建

将筛选得到的活性成分靶点和AD 疾病靶点利用R 语言取交集并绘制韦恩图，将交集靶点导入到STRING 数据库，选择物种为“Homo sapiens”（人源）、最小相互作用阈值（medium confidence）设为“0.4”，得到蛋白质-蛋白质相互作用（PPI）网络。运用Cytoscape 3.7.0软件分析PPI网络拓扑属性，并筛选其中的关键靶点。

1.5 GO 功能与KEGG 通路的富集分析

将黄精防治AD 的关键靶点录入Metascape 平台（http://metascape.org/），输入物种（Input as species）和分析物种（Analysis as species）均选择 “H.sapiens”，P＜0.01，对黄精防治AD 关键靶点进行GO 注释分析和KEGG 通路富集分析。

1.6 黄精防治AD 成分-靶点-通路网络图的构建

将筛选所得有效成分、关键靶点以及靶点所属信号通路导入Cytoscape 3.7.0 软件，构建黄精防治AD 成分-靶点-通路网络。

1.7 分子对接

运用Cytoscape3.7.0 软件对筛选的关键靶点与活性成分进行分子对接，同时以经FDA 认证的临床防治AD 的药物多奈哌齐（Donepezil）、加兰他敏（Galanthamine）、卡巴拉汀（Rivastigmine）、美金刚（Memantine）为阳性对照进行分子对接，在Uniprot 数据库（http://www.uniprot.org)中搜索关键靶点对应的Entry，在PDB 数据库（http://www.rcsb.org）中下载靶点的3D 结构。用Discovery Studio 2016 软件对其进行去水、加氢、分配电荷等处理，运用LibDock 模块与活性化合物及阳性药进行分子对接。

2 结果

2.1 黄精活性成分

通过TCMSP 数据库、相关文献调研以及实验室获取对黄精的化学成分进行收集，共得到105 个化合物。利用Swiss ADME 平台对所收集到的成分进行类药性筛选后，共有54 个符合条件的化合物，见表1。

表1 黄精活性成分

2.2 靶点预测

基于Swiss Target Prediction 平台预测活性成分的潜在靶点，共得到4 463 个基因靶点，根据Probability＞0.12 进行筛选并删除重复值后共得到152个潜在活性成分靶点。利用OMOM、Drugbank 以及GeneCards 疾病数据库对“Alzheimer's disease”相关基因进行检索，合并后删去重复值共得到1 597 个潜在疾病靶点。

2.3 黄精防治AD 成分-靶点PPI 网络的构建

将潜在黄精活性成分靶点与AD 疾病靶点取交集，并通过R 语言绘制韦恩图，得到黄精成分-AD 共同靶点66 个，见图1。将共同靶点在String 数据库中进行PPI 网络分析，最小相互作用阈值设为“0.4”，形成376 个蛋白互作关系对，见图2。利用Cytoscape3.7.0 对PPI 网络进行分析，由于网络节点“degree”中位数为9，故以“degree”大于等于2 倍中位数的值（degree ≥18）为条件进行筛选，得到14 个候选靶点；然后对其进行degree、betweenness、closeness 计算分析，再以大于等于中位数的值进行筛选（degree ≥22、betweenness ≥2.07、closeness ≥0.867），得 到5 个关键 的防治AD 的靶点，即SRC、PTGS2、MMP9、EGFR、STAT3，见图3。

图1 黄精成分-AD靶点韦恩图

图2 黄精成分-AD靶点PPI网络

图3 黄精防治AD成分的PPI网络筛选

2.4 基因功能与通路富集分析

利用Matescape 数据平台对66 个黄精防治AD的潜在靶点进行GO 注释分析和KEGG 通路分析，利用GraphPad Prism 9.0.0 绘制热图，结果见图4。

图4 黄精中有效成分对AD潜在靶点的富集分析

GO 注释分析包括生物过程（Biological Process，BP)，细胞组 成（Cellular Component，CC）和 分子功能（Molecular Function，MF）三个部分。其中生物过程排名靠前的有炎症反应（inflammatory response）、对无机物的反应（response to inorganic substance）、活性氧 代谢过 程（reactive oxygen species metabolic process）、激酶活性的正调控（positive regulation of kinase activity）；细胞组 成中靠前的有受体复合物（receptor complex）、膜阀（membrane raft）、膜 侧（side of membrane）、轴突（axon）；分子功能中靠前的有氧化酶活性（oxidoreductase activity）、蛋白质激酶活性（protein kinase activity）、核受体活性（nuclear receptor activity）、电子传输活动（electron transfer activity）。KEGG 通路富集分析中，排名靠前的有癌症信号通路（Pathways in cancer）、EGFR 酪氨酸激酶抑制剂抵抗（EGFR tyrosine kinase inhibitor resistance）、内分泌抵抗（Endocrine resistance）。

2.5 黄精防治AD“活性成分-靶点-通路”网络构建

将黄精成分、作用靶点和KEGG 通路信息导入Cytoscape 3.7.0 构图软件，构建黄精防治AD“活性成分-靶点-通路”网络，见图5。该网络中包括108 个节点，372 条边。108 个节点中20 个节点为黄精防治AD 涉及的活性成分，66 个节点为黄精防治AD 作用靶点，20 个节点为AD 靶点参与的信号通路。该网络说明黄精防治AD 作用可能具有多成分、多靶点、多环节作用的特点。

图5 黄精防治AD成分-靶点-通路网络图

2.6 分子对接验证结果

将PPI 网络中筛选的5 个靶点作为黄精抗AD的关键靶点，与黄精抗AD 的20 个活性成分以及临床防治AD 的药物多奈哌齐（Donepezil）、加兰他敏（Galanthamine）、卡巴拉汀（Rivastigmine）、美金刚（Memantine）进行分子对接，并以对接打分值构建热图，见图6。其中，阳性药中与5 个关键靶点对接打分最高的是多奈哌齐，最低的是美金刚；并且20 个化合物中，与SRC（PDBID:1Y57）对接打分高于多奈哌齐的有10 个化合物，高于加兰他敏的有19 个化合物，高于卡巴拉汀的有20 个化合物；与EGFR（PDBID：1Z9I）对接打分高于多奈哌齐的有4 个化合物，高于加兰他敏的有17 个化合物，高于卡巴拉汀的有18 个，20 个化合物的对接打分均高于美金刚；与PTGS2（PDBID:5F19）对接打分高于多奈哌齐的有2 个化合物，高于加兰他敏和卡巴拉汀的均有17个化合物，高于美金刚的有20 个化合物；与STAT3（PDBID6NJS）对接打分高于加兰他敏的有14 个化合物，高于卡巴拉汀的有17 个化合物，高于美金刚的有20 个化合物；与MMP9（PDBID:6ESM）的对接打分高于多奈哌齐的有5 个化合物，高于加兰他敏的有11 个化合物，高于卡巴拉汀的有15 个化合物，高于美金刚的有19 个化合物。结果表明，多数黄精活性成分与网络关键靶点具有较好的结合能力。

图6 黄精活性成分与关键靶点对接得分热图

3 讨论

目前，防治AD 的药物多作用于单靶点，只能改善中轻度AD 的症状，并不能预防、终止和逆转AD的进程的发展。中药具有多靶点、多途径作用的特点，对防治AD 这种复杂性疾病有其独到的优势，具有极大的潜力。已有动物实验表明黄精多糖可以改善APP 转基因小鼠海马CA1 区突触界面［13］，减少海马神经元的凋亡［14］，可显著改善AD 大鼠海马的病理改变［15］。但是，其作用机制尚不明确。因此，本研究基于多成分、多靶点、多途径的研究思路，应用网络药理学技术，分析黄精防治AD 的靶点，构建黄精防治AD 靶点的交互作用网络，富集防治AD 相关的生物过程及信号通路，阐述黄精防治AD 的作用机制，为黄精的临床应用以及推广提供科学依据。

对黄精防治AD 的作用网络与潜在机制的研究结果表明：黄精中可能有20 个成分对防治AD 有显著效果，有研究证明apigenin 可以通过调节氧化还原失衡、抑制神经细胞凋亡等机制发挥神经保护作用［16］；异甘草素（isoliquiritigenin）可以通过促进或维持抗氧化能力和抑制神经炎症来保护脂多糖诱导的认知障碍和神经元损伤［17］。此外，该文收集到66 个黄精防治AD 的靶点，表明黄精防治AD 是通过多成分、多靶点作用的结果。

从构建的PPI 网络可知，黄精与AD 靶点存在密切作用关系，核心靶点有5 个，主要为EGFR、SRC、PTGS2、STAT3、MMP9。研究表明，PTGS2 基因也称为环加氧酶2 基因（COX2），在中枢神经系统的炎性细胞中被普遍表达,可以通过抑制神经元凋亡和炎症，同时促进AD 中的神经元生长［18］。有研究显示，在AD 小鼠中STAT3 的表达会增加，可能与AD 的慢性炎性损伤相关，在AD 的发病过程中，STAT3 的活化可介导保护反应［19］。那么，黄精有可能是通过抑制炎症反应，进而达到防治AD 的作用。

进一步对其进行GO 分析和KEGG 通路分析，GO 富集分析显示，黄精防治AD 主要是通过炎症反应、对无机物的反应、活性氧代谢过程、激酶活性的正调控以及对Aβ 的反应等生物过程发挥作用。KEGG 通路富集结果显示，癌症信号通路、EGFR 酪氨酸激酶抑制剂抵抗、内分泌抵抗以及5-羟色胺能突触等是黄精防治AD 的主要通路。其中，排名靠前的5-羟色胺能突触、NF-κB 信号通路与神经病变类疾病发病机制息息相关。研究表明，5-HT 受体5-HT6 活化时可增强抑制性的GABA 的功能产生，并因此降低胆碱能、谷氨酸能神经元的活性，从而改善认知障碍功能［20］。AD 患者脑神经细胞变性与NF-κB 信号通路的活化有关。NF-κB信号通路可激活淀粉样蛋白通路以促进Aβ 的形成，同时也是炎症和氧化应激反应的主要调节方式［21］，这也与GO 分析中的炎症反应、对Aβ 的反应以及对氧化应激的反应等生物过程相符合。同时，黄酮类成分可以通过抑制氧化应激及清除自由基、减少Aβ 形成、抑制炎症因子表达，从而有效阻断AD 的疾病进展［22］。

综上所述，本研究系统地分析了黄精防治AD的作用机制，揭示了黄精防治AD 的活性成分、作用网络和潜在作用机制，证明了黄精防治AD 具有多成分、多靶点、多通路协同作用的特点。但是对于黄精防治AD 的具体作用靶点及通路仍需进行进一步实验，本课题组后续将对黄精作用于AD 大鼠后的血液、脑组织进行分析，以研究黄精防治AD的活性成分、作用靶点及通路。