基于HPLC 建立建昌帮姜天麻炮制前后主成分含量测定方法

邓红，陆美霞，欧阳歆怡，雍蕾，邓捷，叶喜德

1.江西中医药大学附属医院，江西 南昌 330006；2.江西中医药大学，江西 南昌 330004

天麻是兰科植物天麻Gastrodia elataBL.属植物的干燥块茎，有平肝息风、通络止痛之功，常用治惊痛抽搐、肢体麻木、眩晕等证［1］。主含多糖、酚类、挥发油、苷类等成分，有降血脂、抗衰老、抗肿瘤、抗头痛、抗氧化、抗凝血、抗炎等多种药效作用［2-3］。对天麻炮制方法，历代文献多有记载。如《雷公炮炙论》首载“蒺藜子制天麻”法［4］；唐代《银海精微》载“天麻炒至性存”［5］；《颅囟经》以“酒浸一夜”［6］；《补辑新修本草》有“爆干”制法［7］。宋代文献常以酒制天麻为主，如《史载之方》《太平惠民和剂局方》《传信适用方》《扁鹊心书》等［8］。而“姜制法”早在清《幼幼集成》就有记载［9］；直到现代，炮制天麻常以蒸制和切制法为主，对辅料炮制研究较少。

姜制天麻是江西“建昌帮”特色饮片。生姜为辛温之品，有“呕家圣药”之称［10］，所以“建昌帮”提出天麻经姜制后，可祛除天麻之麻味，以减少呕吐之副作用［5］，达到炮制减毒增效之目的。但姜制对天麻药效的影响，主要是通过影响其成分变化而实现。研究表明［11］，采用HPLC 法测定姜制天麻与蒸制、硫黄熏蒸品中天麻素含量时，发现姜天麻中天麻素含量明显高于其他炮制品。本课题组前期以正交试验设计法、多指标成分评价，考察了姜天麻炮制工艺［12］；并通过气相色谱-质谱联用方法，分析了姜天麻炮制前后挥发成分变化差异，结果发现姜制对天麻中的化学成分含量影响较大［13］。基于此，为深入研究姜制对天麻作用的影响，本实验以不同产地不同批次天麻为研究对象，以比较天麻姜制前后主要成分变化差异，目的是探讨姜制对天麻主要化学成分变化的影响，为深入研究姜制天麻炮制机理提供数据支撑。

1 实验仪器和材料

1.1 仪器

Agilent1100 高效液相色谱仪，电热鼓风干燥箱（GZX-9076MBE，上海博迅实业有限公司医疗设备厂），超声波清洗器（KQ-500E，昆山市超声仪器有限公司），低速离心机（TDL-80-2C，上海安亭仪器厂），十万分之一电子天平（FA1004N，上海精密科学仪器有限公司），数字恒温水浴锅（HH-6，国华电器有限公司）。

1.2 试剂试药

天麻素（批号150927，纯度≥98%）、对羟基苯甲醇（批号150708，纯度≥98%）购于四川省维克奇生物有限公司；巴利森苷E（PE，批号CHB180224，纯度≥98%），巴利森苷A（PA，批号CHB180232，纯度≥98%），巴利森苷B（PB，批号CHB180233，纯度≥98%），巴利森苷C（PC，批号CHB180234，纯度≥98%）均购于成都克洛玛生物科技有限公司；无水乙醇（分析纯）、甲醇（色谱纯）、乙腈（色谱纯）、磷酸（色谱纯）均购于西陇科学股份有限公司；纯净水购于杭州娃哈哈集团有限公司；天麻药材来源信息见表1。天麻和生姜经江西中医药大学药学院刘应蛟副教授分别鉴定为兰科天麻（Gastrodia elataBL.）干燥块茎、姜科植物姜（Zingiber officinaleRosc）的新鲜根茎。

表1 10批次天麻药材来源信息

2 实验方法与结果

2.1 姜天麻的制备

根据《建昌帮炮制规范》中姜制天麻法取原药材，加入12%姜汁（1 kg 生姜用1 kg 水），闷润1～2 d，中间颠簸，撒上适量的明矾粉，搅拌均匀，待生姜、矾汁充分吸收后，捞起晒去表皮的水分，用武火隔水蒸1～2 h；放入硫黄柜用定量的硫黄（100 kg 药材用0.5 kg 硫黄）熏2～3 h，取出；切斜薄片或长薄片晾晒干，即得。

2.2 色谱条件

色谱柱Diamonsil-C18（4.6 mm×200 mm,5 µm）；流动相：乙腈（A）-0.05%磷酸溶液，梯度洗脱：0～20 min，5%→30%A；20～25 min，30%→95%A；检测波长：220 nm；流速：1.0 mL/min；柱温：30 ℃；进样量：10 µL。

2.3 标准品溶液的制备

精密称取各对照品适量，加乙腈-水（3∶97）溶液制成1 mL 分别含天麻素、对羟基苯甲醇、PA、PB、PC、PE 分别为1.003、0.308、0.508、0.994、0.474、0.444 mg 的混合对照品溶液，备用。

2.4 供试品溶液的制备

取天麻生品和姜制天麻粉末各2 g，精密称定后加30 mL 70%乙醇，称定重量后在80 ℃下超声（400 W，40 kHz）40 min，放冷，用70%乙醇补足重量，滤过，精密吸取续滤液10 mL 于蒸发皿中，水浴蒸干，残渣用乙腈-水（3∶97）复溶后移至10 mL 容量瓶中并定容至刻度，滤过，取适量滤液离心（3 000 r/min）10 min，过0.22 µm 滤膜，得供试品溶液，备用。

2.5 系统专属性与适应性考察

将混合对照品溶液和供试品溶液各进样10 μL，按“2.2”项下条件测定，结果天麻素、对羟基苯甲醇、PA、PB、PC、PE 保留时间分别为6.492、9.832、14.611、15.632、17.533、11.500 min，各色谱峰分离度良好，见图1。

图1 HPLC图：A.混合对照品；B.生天麻；C.姜天麻

2.6 线性关系考察

将“2.3”项下的对照品溶液分别精密吸取1、2、3、4、5 mL 置于10 mL 容量瓶，用乙腈-水（3 ∶97）稀释至刻度，各精密吸取10 μL，按“2.2”项下色谱条件，以对照品浓度为横坐标，峰面积为纵坐标，绘制标准曲线，结果见表2。

表2 回归方差、相关系数、线性范围检测结果

2.7 精密度考察

按“2.2”项下色谱条件，将混合对照溶液连续进样6 针，并计算出天麻素、对羟基苯甲醇、PA、PB、PC、PE 6 个成分峰面积的RSD 值分别为0.11%、0.18%、0.43%、0.80%、0.32%、0.70%，表明仪器精密度良好。

2.8 重复性考察

采用“2.4”项下方法，将同一批供试品粉末平行制备6 份样品溶液，按照“2.2”项下色谱条件进行检测，并计算6 个指标成分峰面积RSD 值，结果分别为1.20%、1.50%、1.40%、1.80%、2.00%、1.30%，说明方法重复性良好。

2.9 稳定性考察

按“2.3”项下色谱条件，检测制备0、2、4、8、12、24 h 后的同一天麻供试品溶液，并计算出6 个指标成分峰面积RSD 分别为1.10%、0.50%、0.30%、1.20%、1.10%、0.90%，说明供试品在24 h 内稳定性良好。

2.10 加样回收率试验

称量已知含量样品（S1）适量，分别加入高、中、低三种不同浓度混合标准品溶液（6 种成分高、中、低浓度分别为天麻素：1.003、0.669、0.502 mg/mL；对羟基苯甲醇：0.308、0.205、0.154 mg/mL；PA：0.508、0.339、0.254 mg/mL；PB：0.994、0.663、0.497 mg/mL；PC：0.474、0.316、0.237 mg/mL；PE：0.444、0.296、0.222 mg/mL），按照“2.4”的步骤进行配制，并对6 个指标成分进行了测定，计算出6 个指标成分平均回收率为99.80 %、100.67 %、98.44 %、99.81 %、99.89 %、101.66 %，RDS 分别为2.30 %、2.50 %、3.10 %、2.80 %、2.10 %、2.80 %。

2.11 含量测定

取10 批天麻及10 批姜制品粉末，按“2.4”项下方法制备供试品溶液，在“2.3”项色谱条件下进行检测，记录色谱图和峰面积，计算各指标成分含量，结果显示天麻姜制前后6 个指标成分均有明显的变化。姜制前后天麻素含量范围分别为0.15%～0.54%、0.32%～0.72%；对羟基苯甲醇分别为0.01%～0.14 %、0.01%～0.10%；PA 分别为0.20%～1.31%、0.27%～0.95%；PB 分别为0.18%～0.61%、0.23%～0.66%；PC 为0.02%～0.11%、0.06%～0.16%；PE 为0.09%～0.19%、0.12%～0.31%。结果表明天麻素、PB、PC、PE 含量有所升高，对羟基苯甲醇、PA 含量有所下降，见表3、表4。

表3 天麻含量测定结果 %

表4 姜天麻含量测定结果 %

3 讨论

天麻素、巴利森苷、对羟基苯甲醇、腺苷等均为天麻主要活性成分［14］。在《中国药典》（2020 版）中，仅以天麻素和对羟基苯甲醇两个成分作为天麻质量评价指标［1］。研究表明，天麻多糖具降血脂、镇痛、提高免疫力、改善记忆、抗焦虑、抗惊厥、抑制心肌细胞凋亡、抑制心脏肥大和纤维化改善代谢等多种作用［15］，说明天麻活性成分可通过多种途径发挥多靶点药理作用。为此，本研究为扩大天麻活性成分检测范围，以天麻素、对羟基苯甲醇、PA、PB、PC、PE 等6 个成分为研究对象，并作为姜制天麻炮制前后主要差异成分的检测指标，目的是探讨姜制对天麻主要成分变化的影响，为深入研究天麻炮制机理提供数据支撑。

结果表明，天麻经姜制后其主要成分含量均有不同程度的变化，其中天麻素、PB、PC、PE 含量有所升高，对羟基苯甲醇、PA 含量下降。而造成这种成分含量变化的主要原因，可能是由于天麻中的巴利森苷类成分，容易在外力作用下发生结构变化所致，如巴利森苷A 可在自身酶作用下降解为对羟基苯甲醇与巴利森苷B［16］。依照本实验对羟基苯甲醇含量下降结果，可间接说明该化合物有可能发生结构变化，但这种变化的深层次原因仍需有待深入探究。综上所述，本实验建立天麻6 个指标成分的测量方法，可为天麻和姜天麻质量标准研究提供依据，也为深入研究天麻炮制变化机理提供参考。