肿瘤微环境与乳腺癌发生发展

吉丽银，符策岗

(1中南大学湘雅医学院附属海口医院乳甲外科，海口 570208；2上海市第六人民医院海口骨科与糖尿病医院骨科，海口 570000)

乳腺癌（breast cancer, BC）是乳腺上皮细胞在多种致癌因子的作用下，发生增殖失控的现象，其发病率位于女性恶性肿瘤的首位，也是全世界妇女肿瘤相关死亡的主要原因[1]，常被称为“粉红杀手”。近20年来，研究表明BC的进展不仅取决于肿瘤本身的特质，更依赖于肿瘤微环境（tumor microenvironment, TME）。TME中存在有免疫细胞——肿瘤浸润淋巴细胞（tumor infiltrating lymphocyte, TIL）和嗜中性粒细胞，基质细胞——成纤维细胞、内皮细胞、脂肪细胞等，以及肿瘤细胞等等[2]。TME有促进肿瘤的发生发展的标志性特征，如血管生产、上皮-间充质转化（epithelial-mesenchymal transformation, EMT）、增殖、侵袭和转移[3]。近期有报导表明，除常见的T淋巴细胞、树突状细胞（dendritic cell, DC）、肿瘤相关巨噬细胞（tumor associated macrophages, TAMs）外[4]，肿瘤相关脂肪细胞（cancer associated adipocytes, CAAs）、肿瘤相关嗜中性粒细胞（tumor-associated neutrophils, TANs）等对肿瘤的发生发展也有重要的作用。本文综述总结近期肿瘤微环境相关因素对BC发生发展的研究进展，并讨论它们作为治疗靶点和临床生物标志物的潜力。

1 肿瘤相关脂肪细胞

脂肪细胞是乳房主要的基质细胞，它除了分化外还可以在许多生理及病理过程中发生去极化和转分化[5]。越来越多的证据支持脂肪细胞和肿瘤细胞之间存在相互作用，且脂肪细胞参与BC发生、发展的所有进程[6]。肿瘤细胞与脂肪细胞的相互作用可以增强肿瘤细胞的侵袭性，肿瘤修饰脂肪细胞被称为CAAs。已有报导提出CAAs驱动肿瘤进展的一些机制，但肿瘤细胞修饰脂肪细胞复杂作用的分子机制尚未完全阐明[7]。有研究发现CAAs与成熟脂肪细胞存在明显的区别：首先是体积、脂质含量和脂肪细胞分化标记物的表达，过氧化物酶体增殖物激活受体γ（peroxisome proliferator-activated receptor γ, PPARγ）和共激活因子CCAAT/增强子结合蛋白α（CCAAT/enhancer binding protein α, C/EBPα），导致形状不规则和小/分散的脂滴[8]，使它们类似于棕色脂肪细胞；与此相应，CAAs中的解偶联蛋白1也存在高表达现象[9]；同时，它们呈现出一种活化的表型。CAAs重组其肌动蛋白细胞骨架，增加成纤维细胞样生物标志物。此外，在代谢变化方面，CAAs增加分解代谢过程，释放代谢产物，如乳酸、丙酮酸、游离脂肪酸（free fatty acids, FFAs）和酮体[10]。

与来自多种组织类型（前列腺、胰腺、黑色素瘤、肺、卵巢、肝癌和白血病）的肿瘤细胞共培养[11]以及在人BC侵袭前的体内肿瘤细胞共培养[12]实验中，证实了CAAs活化表型。与远离肿瘤或来自健康供体的脂肪细胞相比，肿瘤发生侵袭前的脂肪细胞更小，并表达CAAs相关分子。此外，在肿瘤中心很少发现脂肪细胞，而TME中存在大量成纤维细胞样细胞，这表示其来源于脂肪细胞脱分化。虽然尚未发现脂肪细胞源性成纤维细胞（adipocyte-derived fibroblasts, ADFs）的特定标记物，但Bochet等证明这些细胞在小鼠乳腺癌组织中积累，并促进肿瘤周围的结缔组织增生反应[13]。动物模型谱系追踪研究支持了纤维母细胞可能来源于脂肪细胞这一说法，这些动物模型包括生理（如泌乳乳腺[14]）和病理（纤维化真皮[15]和脂肪肉瘤[16]）条件。

脂肪形成是间充质干细胞在脂肪生成刺激下分化为脂肪细胞的过程。这是一个复杂和高度协调的程序，包括细胞外信号和复杂的转录因子和辅助因子网络，例如PPARγ和C/EBPα，是脂肪形成的关键调控因子，且二者之间之形成一个正反馈调节回路[17]。这个高度调控的转录程序在细胞内和细胞外因子信息转导信号通路下游被激活。Wnt[18]，Hedgehog[19]，Notch[20]和转化生长因子β（transforming growth factor β, TGFβ）[21,22]等信号通路已经成为脂肪形成过程的关键调节信号。同时，也发现了一些新的涉及脂肪形成的转录因子调控机制[23-25]。此外，越来越多的miRNA已被发现是调节脂肪形成的关键转录调节因子，可以对多个基因的表达进行调控。

肿瘤细胞对脂肪细胞表型的修饰在肿瘤细胞和TME的其他细胞中具有强烈的诱导效应。体外和体内实验表明，CAAs在促进BC的增殖、血管生成、迁移和侵袭方面发挥重要作用[26]。CAAs分泌的大量分子和代谢物可以直接或间接地介导这些作用，通过诱导肿瘤免疫抑制微环境。揭示CAAs衍生分子在BC进展中的功能和机制对建立潜在的治疗干预至关重要。其中最重要的就是脂肪因子，是由脂肪细胞分泌的具有自分泌和旁分泌功能的细胞因子，包括瘦素[27]、脂联素[9]、白细胞介素6（interleukin 6, IL-6）[28]和自身毒素（ATX）[29]等脂肪因子，这些来自CAAs的受损分泌物促进癌症侵袭表型；其次是代谢重编程，其适应性机制是癌症的特征之一，在其他癌症特征如迁移、侵袭和转移中也有重要作用，通过刺激分解代谢途径，如自噬、糖酵解和脂解，从基质细胞中隔离代谢底物，包括乳酸、谷氨酰胺和脂肪酸，这些代谢物被用作癌细胞合成代谢的底物[30]。此外还有细胞外基质重塑[31]以及CAAs代谢产物对肿瘤免疫微环境的调控[32,33]。

目前的证据表明，在TME中发生非常复杂的情况，如分化阻断、去分化和转分化，可能会引导脂肪细胞到CAA表型，这是癌症进展的关键。脂肪细胞作为肿瘤进展的积极参与者，正在成为治疗BC的新靶点，未来可以开发针对脂肪细胞和/或癌细胞的新药，以阻止脂肪细胞-肿瘤细胞的恶性循环，防止癌症进展。

2 肿瘤相关嗜中性粒细胞

嗜中性粒细胞在TME中广泛存在，以往一直都认为其对肿瘤的发生发展无显著影响。但近期的研究表明这种存活期较短的细胞可以影响慢性进展性疾病。在人体中，嗜中性粒细胞是最常见的循环免疫细胞。在炎症的情况下，它们作为第一效应细胞出现在炎症部位，通过分泌细胞因子和趋化因子来调节炎症反应。多项研究表明，肿瘤进展与嗜中性粒细胞密切相关[34]。传统上认为，TME中的嗜中性粒细胞的存在可能是一种防御免疫反应的指标。然而越来越多的证据表明，嗜中性粒细胞通过旁分泌调节，可以增强局部肿瘤的生长，这些细胞也积极参与肿瘤向远处转移的进展[35,36]。中性粒细胞诱导的炎症也可能在广泛的慢性综合征和肿瘤进展的发病机制中发挥作用。值得注意的是，各种类型的癌症患者外周血中性粒细胞的数量显著增加。最近，外周血中性粒细胞与淋巴细胞比率（NLR）的增加已被视为癌症患者总体生存期较差的独立预后指标[37,38]，同时有研究表明乳腺癌患者外周血液中NLR升高与其预后较差密切相关[39]。一些临床试验报导，与其他循环中性粒细胞相比，TANs可能具有更长的循环时间[40]。这可能是由于肿瘤和基质细胞产生的包括粒细胞集落刺激因子(granulocyte colony-stimulating factor, G-CSF)、IL-6、血管内皮生长因子α（vascular endothelial growth factor, VEGF）和IL-1β等细胞因子共同作用的结果[41]，不仅可以刺激中性粒细胞成熟和发育，还诱导其在肿瘤发生中发挥促进作用。在肿瘤环境中，TANs可影响肿瘤细胞增殖、组织重塑、血管生成、上皮遗传不稳定性和抑制淋巴细胞介导的免疫[42]。

中性粒细胞被趋化因子受体2（CXCR2）的配体(如CXCL1、2和5)吸引到肿瘤发生部位，并发挥关键的炎症作用[43]。在中性粒细胞中，另一种重要的可与CXCR1或CXCR2结合的趋化因子是IL-8。这些受体由内皮细胞、粒细胞（包括中性粒细胞）以及其他免疫细胞（如巨噬细胞和肥大细胞）表达。许多研究已经发现IL-8在一些癌症（如BC）的终末期会出现过度表达的情况。IL-8除了直接增加肿瘤细胞的增殖、迁移和侵袭外，还能增强中性粒细胞对肿瘤环境的浸润，从而通过中性粒细胞分泌的酶在肿瘤细胞的进展和迁移潜能中发挥重要作用。此外，也有研究表明类二十烷白三烯B4（eicosanoid leukotriene B4, LTB4）、损伤相关分子模式（damage-associated molecular patterns, DAMPs）如高迁移率族蛋白B（high mobility group box 1, HMGB1）等这些蛋白能够通过激活CD11b/CD18整合蛋白来增加中性粒细胞的趋化性[44]。这些免疫细胞积极参与肿瘤生长的各个方面，包括肿瘤起始、血管生成、转移和增殖。一些因素，如活性氧（reactive oxygen species, ROS）、活性氮（reactive nitrogen species, RNS）或中性粒细胞释放的蛋白酶有助于肿瘤启动[45]。中性粒细胞弹性蛋白酶（neutrophil elastase, NE）刺激肿瘤细胞减少胰岛素受体底物-1（insulin receptor substrate-1, IRS-1）。IRS-1水平降低可促进PI3K与血小板衍生生长因子受体（platelet-derived growth factor receptors, PDGF-R）的相互作用，进而促进肿瘤细胞增殖[46]。通过环氧合酶2（cyclooxygenase-2, COX-2）介导的前列腺素E2合成促进肿瘤细胞增殖。中性粒细胞可通过增强肿瘤细胞的侵袭性、增加肿瘤细胞定植和细胞外基质降解而加速肿瘤转移。调控基质金属蛋白酶9（matrix metalloproteinase-9, MMP-9）参与激活VEGF以增强血管生成，人中性粒细胞来源的MMP-9显著刺激血管生成，这些来自肿瘤浸润的中性粒细胞的MMP-9同时控制肿瘤内细胞浸润和肿瘤血管生成。阻断中性粒细胞聚集或药物抑制VEGFα和TANs来源的MMP-9可能有助于同时预防肿瘤内细胞浸润和血管生成。

近年来，TANs形成细胞外诱捕网（extracellular traps, NETs）的能力得到广泛的研究，结果表明，NETs由DNA支架与金属蛋白酶（MMPs）和各种细胞质蛋白组成，包括组织蛋白酶G、乳铁蛋白和中性粒细胞弹性酶，活化的中性粒细胞在肿瘤微环境中形成NETs，在肿瘤进展中发挥促肿瘤作用[47]，并且发现在BC患者血浆中NET水平高于健康对照组[48]。Casbon等人通过探索BC的多阶段小鼠模型，发现侵袭性BC细胞介导骨髓细胞重编程，在骨髓分化的早期生成免疫抑制中性粒细胞[49]。TME中的其他细胞也可能参与中性粒细胞趋化因子的分泌。有人认为，在小鼠转移性BC模型中，T细胞来源的IL-17诱导成瘤性中性粒细胞浸润，从而导致肿瘤快速进展。此外，γδ T细胞释放IL-1β诱导IL-17，导致中性粒细胞G-CSF依赖的扩张和极化，增加BC转移[50]。在肿瘤环境中，调节TANs功能的另一个因素是VATPase α2亚型（α2NTD），该多肽在侵袭性BC细胞上高度表达。α2NTD的增加会上调中性粒细胞促炎因子的分泌，这与肿瘤细胞的侵袭有关[51]。中性粒细胞能够破坏基底膜，长期以来被认为可以介导肿瘤细胞的侵袭和远处转移。另一项研究发现，通过抑制IL-8基因表达和减少TANs浸润，可以抑制中性粒细胞介导的肿瘤细胞迁移的增加[52]。有报道称IL-8的表达与三阴性BC的不良预后有关，靶向IL-8信号可能会改善肿瘤治疗[53]。据报道，在细胞毒性化疗期间，中性粒细胞减少与几种癌症的高生存率相关，在现实环境中中性粒细胞计数较低的患者早期疾病进展的风险可能较低[54]。此外，根据BC辅助化疗的研究，在治疗过程中细胞毒性作用增强的患者比没有毒性作用的患者预后更好[55]。有研究表明，NE在可以直接通过溶解肿瘤基质或间接通过这种蛋白酶级联促进癌细胞的侵袭和转移，BC患者NE过表达也与预后不良相关。NE在介导全身变化的若干机制中发挥着重要作用，尤其是细胞因子风暴的发生机制。然而，有研究发现了NE在BC中的一种新功能，这与之前的报道不一致。结果表明，几乎所有由TANs产生的NE都被BC细胞所吸收。NE的吸收与cyclin E1在BC细胞株中的低分子量表达有关，这增加了它们对肽特异性细胞毒性T淋巴细胞裂解的敏感性。因此，NE可以被认为是先天免疫系统与BC的适应性免疫反应的重要连接者。

最近，越来越多的研究表明中性粒细胞是BC转移前因子[56]。肿瘤中中性粒细胞的存在通常表明对肿瘤的免疫应答失败。TME诱导的TANs是一个独特的中性粒细胞群体，在肿瘤进化的所有阶段[57]，对TANs和TME之间复杂的相互作用有一个总体认识至关重要。中性粒细胞已经成为癌症领域的新参与者，并有成为疾病结局的生物标志物或治疗靶点的潜力[58]。

3 小结

现有证据表明，TME经历非常复杂的方式诱导形成的CAAs与TANs表型，是癌症进展的关键步骤，但其作用以及核心调控网络仍需进一步阐述。它们释放的细胞因子与代谢产物，除了影响癌细胞增殖、侵袭和转移潜能外，还能进一步影响免疫细胞的效应功能，形成免疫反应。因此，需要进一步研究CAAs与TANs作为支持免疫治疗疗效，以及评估作为直接或间接抑制肿瘤进展的靶细胞的可能性。此外，需更加深入地了解触发CAAs与TANs的信号，为治疗癌症提供新的途径。肿瘤诱导的CAA及TANs表型的转录、代谢以及机械生物学控制都值得进一步研究，这可能会为乳腺癌的治疗提供全面的线索。