制备溶致液晶模板分离纯化苜蓿中氨基酸H-Asp（OH）-OH的工艺技术及其机理探索

张 瑞，赵红梅

（1.新疆师范大学 生命科学学院，新疆 乌鲁木齐 830054；2.新疆师范大学 研究生处，新疆 乌鲁木齐 830017）

溶致液晶通常是由一定浓度的表面活性剂与溶剂形成的二元或多元体系，它同时具有液体可流动性和固体各向异性的特点。双亲性的表面活性剂分子在溶液浓度很低时以单体形式存在，或吸附在界面上，随溶液浓度增加。表面活性剂分子可能经过二聚体阶段，形成预胶束，当溶液浓度达到临界胶束浓度以上时，表面活性剂分子通过自组装作用相互缔合形成层状、球状或圆柱形胶束，胶束中分子的极性头部朝向极性介质，非极性尾部相互缔合定向排列，胶束的形成可以使体系能量降低，随浓度的继续增加，胶束将进一步缔合形成液晶态［1-3］。

目前，溶致液晶被用作制备最热门的模板，合成与组装纳米材料［4-6］，在医学领域的药物生产中，用作囊壁材料将药剂封成胶囊，可以达到靶向给药目的。在化学反应中可以提供一种有序的微环境，使化学反应效率急剧提高，低分子构成的溶致液晶中，低分子物质还可以作为反应物直接参与反应，通过改变液晶结构，人为地控制化学反应进程［7］。溶致液晶在采油工业和水处理中的应用也较为广泛。溶致液晶的应用还渗透到食品、纺织等行业［3-7］。另外，生物体的细胞结构，例如，细胞膜和细胞核都是溶致液晶组成的。人体的疾病也与溶致液晶性质的变化有关，设想创造一些校正生物体内溶致液晶态的药物来治疗疾病［8，9］。自从Ehud M等人提出一种膜蛋白结晶的新概念，我国科研人员用脂肽类去垢剂对膜蛋白结晶的研究从没有间断过，包括获取膜蛋白二维晶体或三维晶体过程，脂质分子/去垢剂/膜蛋白体系就是溶致液晶体系［3，10-11］。总之，溶致液晶将在化学领域和生物领域具有广阔的前景。

天然生物分子的分离纯化方法很多，从大类上可分为结晶分离纯化法、膜分离技术、薄层色谱和柱色谱分离法、气相色谱及高效液相色谱法等［12-15］。结晶分离纯化法工艺简单，便于操作，节约成本，所需设备易得到，更适合工业化生产。然而结晶法所用的样品必须是已经用其他方法提纯过的，如果粗提物纯度很差，则很难得到结晶，因为结晶是同类分子自相排列，如果杂质过多，则会阻碍分子的排列［14］。笔者及其研究团队经过大量实验，在观察实验现象，总结实验结果的前提下提出了制备溶致液晶模板结晶纯化天然生物分子的研究思路，一方面使液晶模板作为反应器提供生物分子晶核形成的空间，另一方面使之作为反应物直接参与结晶反应［16-17］，易于控制，可以直接高效地获得纯度相对较高的生物分子结晶体。这种方法避免了样品的前期提纯过程，对粗提物纯度要求不高，甚至可以通过不同生物分子在溶致液晶模板中形成的不同液晶织构，靶向的分离纯化所需目标分子或去除杂质分子。该方法是一种高收率、低成本、操作安全、作用条件温和，适于天然生物分子工业化生产的新型分离纯化技术。前期研究［18］实现了通过制备溶致液晶模板诱导生物分子结晶，达到纯化的目的，发现了在制备适宜的溶致液晶态下，极性溶剂与非极性溶剂会出现交界面，随着溶剂挥发速度不同，交界面会出现微小晶核，在挥发性溶剂不断挥发减少的同时液晶织构也会发生变化，笔者前期研究中提出了液晶织构翻转物理吸附理论可以很好地解释这种现象。文章将制备溶致液晶模板分离纯化苜蓿中氨基酸H-Asp（OH）-OH的实验现象及过程记录下来，同时通过分析，推论出此技术可能的机理假设。文章提出的新型生物分子分离纯化技术及其机理，相关研究目前在国内外尚无人报道过。

制备溶致液晶模板分离纯化天然产物分子机理研究是将溶致液晶理论创造性地应用于生物分子的分离纯化领域，可以发挥基础研究的导向作用，是从附加增值改进研究转向对新概念和新体系的探索性研究和开拓，由于目标分子与杂质分子可能会形成不同的液晶织构形式，因此有可能产生靶向处理目标分子或去除杂质分子的新技术或方法，同时也说明此领域极具研究价值。

1 主要实验材料

1.1 实验材料与试剂

苜蓿（2009年6月在乌鲁木齐市头屯河区采集）、无水乙醇、乙酸乙酯、石油醚（沸程90℃-120℃）（以上均为分析纯）、蒸馏水（本实验室自行制作）。

1.2 主要设备

单凹载玻片、盖玻片、分液漏斗、电热恒温鼓风干燥箱（上海一恒科学仪器有限公司）、电热恒温水浴锅HWS28型（上海一恒科学仪器有限公司）、旋转蒸发仪RE—52A型（上海亚荣生化仪器厂）、电子天平BS223S型（北京多赛多利斯仪器系统有限公司）、循环水式多用真空泵SHB—B88型（郑州长城科工贸有限公司）、偏光显微镜BH200—P型（宁波舜宇仪器有限公司）。

核磁共振检测委托新疆大学理化测试中心核磁共振检测室完成。

2 实验方法

2.1 苜蓿中生物分子提取工艺流程［19-21］

新鲜苜蓿→晾晒→叶、杆分离→分别研磨→过40目筛→浸提→过滤→去除脂肪→真空浓缩→苜蓿活性生物分子粗提物（黄褐色膏状物）。

称取100克苜蓿粉末，按照1：10固液比，取1000mL 70%乙醇，将两者加入浸提锅中，搅拌均匀，密封。置于70℃水浴中，浸提3h.3h后，将浸提液过滤，去除滤渣，收集滤液。将滤液与石油醚（沸程90℃~120℃）1：1比例混合，去除滤液中的脂类，收集到的液体即为苜蓿醇提物。将粗提液用旋转蒸发仪进行浓缩，得到浓缩液为黄褐色。

2.2 制备目标生物分子溶致液晶

制备天然生物分子溶致液晶，以天然生物分子为双亲分子，采用极性溶剂水、非极性溶剂乙酸乙酯和能够与水、乙酸乙酯混溶的助剂乙醇三种极性不同的溶剂制备。对于苜蓿活性生物分子粗提物，先加入水溶解，再加入无水乙醇，将其配制成一定浓度的溶液，然后按不同的体积比分别加入乙酸乙酯，可以通过偏光显微镜判断是否形成相对稳定的色素分子溶致液晶织构。根据对目标分离物极性强弱的分析，本实验通过多次研究最终采用的溶剂比例有两组：①水：乙醇：乙酸乙酯=3：7：7；②水：乙醇：乙酸乙酯=3：7：10，其他条件温度室温28℃，实验室无其他进风措施。

2.3 观察粗提物溶致液晶织构

对上述方法制备的溶致液晶模板进行观察。从加入乙酸乙酯出现浑浊开始，使用单凹载玻片，取样滴入凹槽内，加盖玻片后，连续观察48h.随着挥发性溶剂乙酸乙酯不断挥发，溶液浑浊度及黏度逐渐增大，形成相对稳定的溶致液晶模板，在此过程中对溶致液晶织构的变化进行观察和分析。

2.4 确定适宜的溶致液晶模板结晶目标产物H-Asp（OH）-OH，并对结晶体进行核磁共振检测

对于获得的目标结晶体，用重水溶解，装管进行核磁共振检测，测试氢谱、碳谱及δ谱，进而推测目标结晶体的分子结构式以验证目标产物的获得情况。

3 结果与分析

3.1 制备目标生物分子溶致液晶诱导结晶情况

采用的两组平行实验结果均能够形成结晶体，实验组①结晶出现速度较快，制备液晶态后约30 min就开始出现微小晶核，同时产生褐色膏状物杂质，褐色膏状物杂质中包裹着大量结晶体，且杂质不易分离。实验组②制备液晶态后1.5h.左右出现微小结晶颗粒，之后结晶体逐渐长大，杂质出现量少或基本不出现。

3.2 溶致液晶织构的观察与实验现象分析

制备溶致液晶态在30 min内，目标双亲分子开始进行自我组装，形成立方相织构形式见溶致液晶织构示意图3-a，在溶液中呈现出微小球体结构，此时微球体是透光的。说明液晶织构正在逐渐形成外部为“水包油”型的微球体，而微球体内部为“油包水”型。图1-a中观察到的微球体不断进行震动，大的微球体会“出芽”，小的微球体会聚合，逐渐形成体积基本一致的织构形式。随着挥发性溶剂的不断挥发，微球体表面物质分子不断浓缩，有可能产生目标物质分子结晶晶核。图1-b中可以观察到聚合为较大的微球体表面产生晶核的情况，偏光显微镜下不透光的微球体形成液晶织构，微球体表面因为结晶晶核对偏振光的反射形成微小亮点。图1-c是选用40倍物镜更为清楚地观察到的结晶体在微球体表面生成，微球体由最初的透明态转化为不透明状态，笔者认为这是液晶织构可能发生翻转导致的，当晶核在微球体表面开始生成的同时，晶核镶嵌在微球体表面，加剧了微球体内部“油包水”结构的不稳定，从而使内部结构翻转由“空心”转为“实心”。随着结晶时间的延长，结晶体大量产生，图1-d可以看出2h后结晶体不断增多，视野中的微球体基本上均在表面产生了结晶体。在挥发性溶剂不断挥发的过程中，液晶织构形式可能会有多种并存的情况，图1-e可以看出4h后产生褐色膏状物，观察膏状物内部，可以看到有不同的织构。图1-e-1是在视野中观察到的六角相织构形式（图3），在偏光显微镜的观察下，可以看出六角相织构形式中，结晶体主要在六角相内部产生，表面产生的结晶体较少，图片中可以看出部分内容物从六角相织构中向外溢出现象，由此可以推测这种织构形式对于特定条件下获得目标分子结晶体是有利的。图1-e-2呈现出球状形态，推测由于前面的微球体织构翻转，在相互碰撞中互相融合逐渐增大，微观上形成球体形态，宏观中产生褐色带结晶体的膏状物，盘踞在结晶容器底部。图1-f可以看到10h后载玻片内溶剂完全挥发，呈现出的褐色膏状物形态。

图1观察了实验组①的情况，随着挥发性溶剂的不断挥发，溶致液晶体系开始发生变化，褐色膏状物以微团体形式出现，且其表面附有薄膜包被，而正在此膜内逐渐产生了微小结晶体，此液晶织构下获得的目标分子结晶体，周围混杂较多杂质，后续处理麻烦。虽然在制备溶致液晶4小时后观察到了六角相液晶织构形式，对于获得纯度较高的结晶体有益，但是六角相织构出现的数量比较少，往往伴随着立方相织构同时出现。因此本实验中，这两种液晶织构形式对于后期分离纯化目标结晶体不利，因此进一步分析褐色膏状物非极性较强这一性质，本研究设计了实验组②的配方比例，目的是增大非极性溶剂比例，使溶致液晶织构向层状织构形式进行转变，利用非极性溶剂较大挥发性，使层状织构中目标分子不断浓缩，进而产生结晶晶核，使结晶体不断长大的同时降低非极性杂质对目标结晶体的影响。

图1 实验组①条件下制备溶致液晶模板偏光显微镜下观察到的实验现象

图2观察了实验组②的情况，实验组②中出现的微球体很快消失，随着挥发性溶剂不断挥发，溶液表面出现区域板块，推测液晶织构为层状织构见图3，逐渐形成不规则形态，部分微小结晶体开始出现（图2-a）。

图2 实验组②条件下制备溶致液晶模板偏光显微镜下观察到的实验现象

图3 溶致液晶织构示意图［17］

从图2-b、c、d中可以看出结晶体主要出现在“层状不规则形态”的边缘，研究分析认为这是极性溶液与非极性溶液夹在双亲性目标分子形成的层状织构形式中间。由于非极性溶剂挥发性较强，溶剂不断挥发，在其中的目标分子浓度达到过饱和，体系能量升高，迫使分子定向排列产生了晶核。层状织构中间的极性、非极性溶剂不断挥发，所以形成了局部区域板块，而双亲分子形成的层状织构携带极薄的分子层暴露出来。由于多种杂质分子主要存在于层状织构中，类似于双分子生物膜中夹杂多种蛋白质模型，所以层状织构中间的极性、非极性溶剂不断浓缩的同时杂质析出很少，而随着结晶晶核的形成，层状模板中的目标分子逐渐向层状模板中间的溶剂中进行扩散，进一步促使结晶体长大。当非极性溶剂完全挥发后，层状液晶模板可能发生翻转，此时杂质大量析出并黏附在结晶体表面造成结晶体被杂质污染。理论分析与实际实验结果及现象非常吻合。两组实验中在制备溶致液晶初期，溶致液晶体系温度均发生先升温再降温的显著变化，触觉可察，推测结晶过程有类似化学反应过程的吸热，放热机制，可能可以利用化学反应进行定量与控制。

图4 获得的结晶体形态

静置72h后，弃去上清液，可以获得大量结晶体，实验表明结晶体生成速度与溶质浓度正相关，溶质浓度越高，结晶体生成速度越快，达饱和时结晶体大约在2~5h即可出现并不断生长，为避免杂质析出，必须严格控制结晶体生长时间，一般不超过7天，否则会出现杂质析出，结晶体又溶解等不良现象。

3.3 核磁共振检验结果

图5 核磁共振检测图谱

通过对核磁检测数据的分析，可以初步确定此结晶物分子式为C4H7O4N，化学结构式为

核磁数据13C-NMR（100MHz；D2H）δ：35.10，51.69，173.93，175.06与文献［22］《天然产物核磁共振13C-NMR碳谱分析》对照化合物H-Asp（OH）-OH结构一致。

3.4 溶致液晶模板结晶纯化天然物质分子的实践经验及机理—化学反应模板理论的提出

笔者在长期的制备溶致液晶模板纯化结晶脂溶性色素分子研究工作中总结经验认为：

（1）制备溶致液晶模板分离纯化天然产物分子对生物分子具有选择性，只能适用于部分易于形成液晶态的分子。

①分子链必须是具有刚性或比较刚性的物质，在溶液中，分子链近乎棒状构象；部分平板状分子也可以形成液晶态；

②分子链上具有苯环和氢键等极性基团；

③分子中含有不对称碳原子，具有各向异性等情况，而对于其他分子不适宜使用。

（2）化学反应模板理论可能是溶致液晶模板结晶纯化色素分子的一种机理［17］。

①研究发现，液晶织构在不同的形态下，极性目标分子与杂质分子所形成的复合液晶织构形式也不同。在缓慢浓缩的过程中，可能会形成杂质分子的析出，或极性目标分子以不定形态析出，均出现羽状、丝状、片状等未定型固体形态。溶剂挥发干后溶液呈稠状膏体。只有复合液晶织构在适合的形态下，随着溶剂的缓慢挥发，最终使极性目标分子从织构形式中脱离出来，形成晶核。这时形成液晶的溶剂配比可以在一定的范围内变化，证明了此时的液晶织构形式在范围内相对稳定存在，晶核在该织构形式中产生。

②在一定的温度条件下，溶剂配比适合时，极性目标分子与结构相似或极性相似的杂质分子一同形成稳定的液晶模板，该模板的稳定性主要由范德华力、热涨落力维持，层间作用力较弱，模板柔性强，使模板层面起伏较大，双层易于波动、涨落。随着挥发性溶剂的不断挥发，维持稳定的液晶织构就会有大量的极性目标分子从模板中游离出来进入模板空间，导致液晶体系能量升高，大量极性目标分子在油相中成为过饱和状态，但是液晶体系的这种不稳定状态还不足以导致液晶织构的转变。当目标分子在油相中形成晶核后，液晶体系的不稳定状态得到改善，晶核的生成及晶体的长大可能会对液晶模板的层间距及长程有序性产生影响，长大的晶核由于模板的柔软性，镶嵌在模板中，从外观上看，有大量结晶体悬浮于溶液中。此时杂质分子由于其亲油、亲水性与目标分子相近，也镶嵌于液晶模板之间，或形成不同于目标分子液晶模板的其他液晶织构形式。虽然也会从模板中游离出来进入模板空间，但由于其不能溶入目标分子形成的固态晶格中，在维持模板稳定性作用力的作用下，杂质分子又不断地溶入模板结构中，随着挥发性溶剂的大量挥发，模板之间极性目标分子和杂质分子的溶出溶入逐渐产生动态平衡，目标分子结晶体将不再生长，若继续浓缩，晶核长大后便沉淀至容器底部。当挥发性溶剂快速挥发至一定程度后，原有的液晶态消失形成目标分子的稳定溶液，由于水分子的挥发速率较慢，此时结晶体又会逐渐溶解，结晶体数量可能会有减少或结晶体不再长大。到后期色素结晶体不再长大时，杂质分子在水溶液中不易产生过饱和态，因而也不被析出。此时若继续浓缩，溶剂挥发干后，杂质分子与极性目标分子混杂形成未定型沉淀析出，又形成膏状粗提物形态。

③在溶致液晶模板中结晶目标分子的实验现象类似于化学反应过程，可以把结晶过程看作是化学反应过程并试图按照化学反应的基本理论对其进行分析与研究，从而确定结晶过程中的数量关系，为这一新型分离纯化技术提供理论支持。

4 结论

文章运用溶致液晶理论较好地设计了制备目标分子H-Asp（OH）-OH的溶致液晶模板的溶剂比例，并在实验室条件下成功观察到制备出的不同溶致液晶模板织构形式，其中观察到的有立方相织构、六角相织构、层状相织构，也发现三种织构形式下，均可以出现目标分子结晶体，但是立方相在形成结晶体的同时，液晶织构发生翻转，产生杂质对结晶体的包裹，六角相织构的形成往往与立方相织构的产生混杂在一起，难以单独制备出六角相织构，同样与杂质混杂难以进一步分离，而层状相织构形式的制备，能够较好地解决杂质析出的问题，可以较好地获得纯度相对较高的目标分子结晶体。实验中，较好地运用化学反应模板理论解释了不同液晶织构形式下目标分子结晶体的产生、成长及杂质的析出情况，与实验现象的实际相符合。

对于特定的生物分子，按照化学反应模板理论机制制备目标分子的溶致液晶模板，研究目标分子的溶致液晶行为，采取不同的条件，判断目标分子极性大小，选择合适的极性、非极性混合溶剂，制备不同的目标分子溶致液晶模板，可以实现对目标分子进行结晶纯化的目的。该方法具有高效性及靶向性，是一种高收率、低成本、操作安全、适于天然产物分子工业化生产的新型分离纯化技术。

文章的研究成果验证了溶致液晶理论可以运用于天然生物分子的分离纯化领域。这一理论研究将为生物分子，例如，色素、多糖、生物碱、蛋白质等的分离纯化工业化应用提供新的研究思路，说明了制备溶致液晶模板分离纯化生物分子这一新型分离纯化技术在生物化学、分子生物学领域中可以得到较好的应用，同时也说明该技术在工业化生产中有应用的可能性。这一新型分离纯化技术在工业化生产中的应用对新材料的合成、天然产物的高效分离纯化、降低制药成本、中药制剂的新型加工技术改进等具有良好的推广适用性。