BNIP3L/NIX介导线粒体自噬对缺血性脑卒中作用的研究进展

张凤娟综述，杨 薇审校

脑卒中是一种中老年多发的，具有致残率和死亡率的常见病[1]。脑卒中分为缺血性(ischemic stroke)和出血性(hemorrhagic stroke)两种类型，缺血性脑卒中约占87%[2]。缺血性脑卒中的发生机制十分复杂，涉及兴奋性氨基酸毒性、钙离子超载、炎症反应、细胞凋亡、线粒体功能障碍等，且这些因素相互影响相互联系，形成恶性循环，最终造成不可逆性脑损伤[3]。研究发现，大脑产生的ATP大部分用于神经元生电活动[4]。因此，线粒体提供足够的能量对神经元的兴奋性和存活至关重要。除了产生能量外，线粒体和NADPH氧化酶，是活性氧(reactive oxygen species,ROS)的主要来源，并作为细胞凋亡调节剂[5]。越来越多的证据表明，在各种神经系统疾病中，ROS过量产生与神经元死亡之间存在密切关系，这与脑缺血的发病机制也密切相关[6]。因此，线粒体功能障碍是缺血性脑卒中发展的重要环节，线粒体功能障碍引起的线粒体自噬与缺血性脑卒中是密不可分的。

1 线粒体自噬与缺血性脑卒中

1.1 自噬的概念 自噬的原始科学定义(希腊语，“自食”)是将细胞质成分输送到溶酶体进行降解，自噬货物一般包括胞质蛋白、膜封闭的细胞器、细胞核的一部分，甚至溶酶体本身，从而实现组织细胞的需要或部分细胞器的更新[7]。至少有3种不同形式的自噬-分子伴侣介导的自噬、微自噬和巨自噬[8]。不同类型的自噬在维持组织和细胞内环境稳定中发挥着特定的作用。

1.2 线粒体自噬的概念和过程 线粒体自噬是指细胞通过自噬调控机制选择性清除损伤或功能障碍线粒体的过程，可能在调节线粒体功能和维护细胞生存具有重要作用[9]。线粒体自噬首先起始于受损线粒体的识别，然后被双膜自噬体吞噬，导致选择性降解[10]。线粒体自噬可分为“两步模型”：第一步，首先受损的线粒体被Parkin泛素化，泛素化的线粒体和自噬相关基因ATG上游调控蛋白与自噬小体结合位点发生耦联，第一步不依赖于微管相关蛋白1轻链(LC3-PE) 或隔离膜形成;第二步，形成自噬小体。受损的线粒体被隔离膜逐渐包裹，形成具有双层膜结构的自噬小体，自噬小体与溶酶体融合形成自噬溶酶体，被包裹的线粒体在溶酶体酶的作用下被降解利用。该过程不仅需要LC3-PE及连接LC3与线粒体的接头蛋白p62、optineurin、NBR1的参与同时BNIP3L/NIX在这一阶段也发挥了关键作用。线粒体自噬作为自噬的重要形式之一，参与调控细胞内稳态、增殖、分化、遗传、衰老和死亡等细胞进程，同时也通过控制线粒体质量增强线粒体对环境的应激性[9]。线粒体自噬对于细胞和组织的稳态至关重要，并参与细胞衰老的自然过程以及各种人类疾病，包括癌症、固有免疫疾病、肌肉萎缩症和神经退行性疾病，且其在缺血性脑卒中的发生发展过程中更是扮演着不可替代的角色[11]。

1.3 线粒体自噬及其在缺血性卒中中的作用 Lemasters等人于2005年首次提出线粒体自噬这一概念，其指细胞为维持正常生理过程进化产生的一种利用自噬活动选择性清除损伤线粒体的机制，这一机制可能具有减少由衰老引起的线粒体DNA突变的作用[12]。缺血性卒中是局部脑血流量严重减少，导致严重缺氧和缺糖，而缺氧和缺糖引起的线粒体功能障碍在缺血后数分钟内发生，导致ATP生成减少和活性氧化物(ROS)生成过多[13]。在缺血性卒中中，线粒体自噬可由BNIP3L/NIX通路介导。在脑缺血期间，缺氧会增强BNIP3L和NIX的表达，触发beclin-1从Bcl-2/beclin-1复合体中释放出来，并最终诱导线粒体自噬[14]。事实上，线粒体自噬激活在缺血性中风中的作用是有争议的[15]。适度的线粒体自噬具有神经保护作用，而过度的线粒体自噬则有害[16]。适度的线粒体自噬清除缺血/再灌注损伤的线粒体可以改善线粒体功能，例如平衡ROS和ATP的生成以及抑制细胞凋亡，从而有助于保护脑缺血/再灌注损伤[17]。然而过度的线粒体自噬可能会加剧脑缺血损伤。ROS和活性氮(reactivenitrogenspecies,RNS)是激活线粒体自噬的关键参与者[18]。过氧亚硝酸盐是一种RNS，可促进动力蛋白相关蛋白1(Drp1) 向受损线粒体募集，诱导过度线粒体自噬，从而加重脑缺血后的脑损伤[19]。柚皮苷是一种天然抗氧化剂，可以抑制过氧亚硝酸盐介导的线粒体自噬以防止缺血/再灌注损伤[19]。因此，线粒体自噬在缺血性脑卒中的作用可能是一把双刃剑。

2 BNIP3L/NIX与线粒体自噬

目前研究，线粒体自噬的途径主要分为两大类，一类是通过PINK1/Parkin介导的;一类是涉及线粒体自噬受体蛋白。目前已知的线粒体受体蛋白有：FUNDC1、Bcl2-L-13、Prohibitin2和BNIP3L/NIX[20]。这些受体定位在线粒体上，通过与LC3相互作用介导线粒体自噬。其中BNIP3L/NIX是一种定位在线粒体外膜上的Bcl-2家族蛋白。BNIP3L作为一种线粒体自噬受体，在细胞发育或病理条件下，可以通过与自噬泡相关蛋白LC3结合促进线粒体自噬[21]。BNIP3L转录在多种细胞缺氧条件下被诱导，暗示BNIP3L参与缺氧诱导的线粒体自噬[20]。然而BNIP3L作为一种线粒体自噬相关蛋白的贡献似乎在脑缺血等病理条件下被低估了。因此，进一步鉴定BNIP3L诱导线粒体自噬的分子机制有望为开发脑缺血疗法以调节线粒体自噬过程建立生物学原理。

2.1 BNIP3L的结构与作用 BNIP3L是一种由194个氨基酸组成的蛋白质，主要定位于线粒体外膜，少量定位于内质网膜及核膜[22]。正常生理条件下BNIP3L在心、肝、肾、脑、胰、肺、骨骼肌和胎盘等多种人类正常组织中均有表达，但表达量很低[22]。仅能从人骨骼肌细胞和脑细胞中检测到BNIP3L的低水平表达。BNIP3L蛋白包含以下几个功能结构域：(1)PEST结构域：该结构域位于54-81位氨基酸，富含脯氨酸、谷氨酸、丝氨酸和苏氨酸，参与BNIP3L蛋白的降解；(2)BH3结构域：该结构域位于104-119位氨基酸，参与BNIP3L介导的caspase依赖性线粒体凋亡途径；(3)氨基端结构域(NH2结构域)：该结构域与BH3结构域具有相似的功能；(4)跨膜结构域(TM结构域)和羧基端结构域：该结构域位于164-194位氨基酸，是BNIP3L行使其促凋亡功能最重要的结构域[11]。BNIP3L位于线粒体外膜上，可通过与Atg8家族蛋白直接结合将吞噬细胞(自噬体的前体)募集到线粒体[23]。BNIP3L可能在线粒体自噬诱导中与PARK2协调[23]。

2.2 NIX的结构与作用 NIX是从人胎盘cDNA文库中克隆出来的蛋白质，其56%与BNIP3L同源性，位于线粒体外层，同BNIP3L一样，NIX定位于线粒体，与Bcl-2和Bcl-xl相互作用，可诱导细胞凋亡[24]。另外，BNIP3L和NIX都包含相同的N端LC3相互作用域。在哺乳动物中，丝氨酸残基17和24的磷酸化作用促进BNIP3L/NIX和LC3相互作用，加快线粒体自噬和降解。BNIP3L和NIX的启动子序列中均含有低氧反应元件，受HIF-1调节。低氧条件下，BNIP3L/NIX结合Bcl-2后促使Beclin-1游离，通过磷脂酰肌醇-3-激酶/蛋白激酶B途径诱导Atg-5依赖的自噬发生[9]。因此，BNIP3L和BNIP3L/NIX介导的线粒体自噬可能与机体低氧适应密切相关。BNIP3L/NIX介导的线粒体自噬在许多疾病中发挥着重要的作用。

2.3 BNIP3L/NIX介导线粒体自噬对缺血性脑卒中的作用 BNIP3L/NIX位于线粒体外膜上，在细胞发育或病理条件下作为有丝分裂吞噬受体[21]。研究发现BNIP3L基因缺失显著可阻断缺血再灌注诱导的神经元线粒体自噬，从而加重缺血脑损伤[24]。大量研究发现，BNIP3L作为线粒体自噬治疗卒中干预的潜在靶点[25]。然而，目前尚不清楚如何通过调节BNIP3L来调控缺血神经元的有丝分裂吞噬。BNIP3L在哺乳动物细胞中形成单体或同型二聚体，然而，BNIP3L的同型二聚体和单体对有丝分裂吞噬的作用尚未阐明[26]。因此，进一步研究缺血脑中BNIP3L的分子调控可能为脑缺血提供新的治疗方法。

BNIP3L是介导线粒体自噬的受体相关因子之一。BNIP3L与LC3相互作用，通过其朝向细胞质的LC3相互作用区(LIR)基序将受损的线粒体连接到自噬体，启动线粒体自噬过程[27]。在自然杀伤细胞中，BNIP3L和BNIP3L在清除功能失调的线粒体和线粒体相关的活性氧化物质(ROS)以促进细胞存活方面发挥重要作用[28]。BNIP3L基因敲除小鼠在短暂大脑中动脉闭塞后表现出线粒体自噬受损、梗死体积更大和神经功能缺损更严重[29]。最近在一项关于线粒体5对肿瘤坏死因子α诱导的小胶质细胞BV-2细胞凋亡影响的研究中记录了通过药物诱导的BNIP3L介导的线粒体自噬的上调来诱导细胞保护的可行性[30]。研究表明，BNIP3L基因敲除小鼠在短暂大脑中动脉闭塞后表现出线粒体自噬受损、梗死体积更大和神经功能缺损更严重[29]。Chen等[31]采用短暂大脑中动脉闭塞(tMCAO)建立缺血性脑卒中大鼠模型，在离体细胞水平，观察了TAT-SPK2肽如何防止脑缺血再灌注，探讨BNIP3L/NIX信号通路介导线粒体自噬在缺血性脑卒中的保护作用。结果发现，TAT-SPK2通过激活BNIP介导的线粒体自噬来保护神经元免受缺血/再灌注损伤。Yang等[29]采用大脑中动脉闭塞法建立缺血性脑卒中大鼠模型，观察了缺血性脑卒中大鼠脑梗死体积及LC3、Beclin1、PINK1和Parkin的表达水平，探讨了BNIP3L/NIX信号通路介导线粒体自噬对缺血性脑卒中大鼠的作用。研究发现，BNIP3L敲除( BNIP3L-/-)会损害小鼠的线粒体自噬和加重脑缺血再灌注损伤，这可以通过BNIP3L过表达来挽救，同时可以在Parkin敲除小鼠中观察到BNIP3L过表达的拯救作用，其在脑缺血再灌注后表现出线粒体自噬缺陷。有趣的是，BNIP3L和PARK2双基因敲除小鼠在脑缺血再灌注治疗下表现出协同的线粒体自噬缺陷，这进一步突出了BNIP3L介导的线粒体自噬的作用，因为它独立于PARK2。该研究结果进一步证实了BNIP3L/NIX信号通路通过介导线粒体自噬参与了缺血性脑卒中的病理生理过程，并且在其中发挥保护作用。

因此，BNIP3L/NIX信号通路介导的线粒体自噬在缺血性脑卒中的发生发展过程中发挥着不可替代的作用。如果能够准确调控BNIP3L/NIX介导的线粒体自噬，很可能会找到防治缺血性脑卒中新的治疗靶点和作用机制。

3 小结与展望

缺血性脑卒中是危害人类健康的常见病，尤其是老年人发病率和死亡率较高，如何有效降低缺血性脑卒中的发病率和死亡率已成为临床急需解决的客观难题。缺血性脑卒中发生后，可严重破坏线粒体的形态、结构和功能，引起细胞能量代谢障碍，甚至引发恶性级联反应[3]。线粒体自噬在缺血性脑卒中发生后可以应激性被激活，神经元可以受损的线粒体并将它们转移到星形胶质细胞进行处理和回收，在缺血性神经元损伤和恢复中具有重要作用[32]。BNIP3L/NIX是介导线粒体自噬的关键通路，在调节线粒体自噬和维持线粒体质量等发面发挥着重要作用[29]。BNIP3L基因缺失，可阻断缺血再灌注诱导的神经元线粒体自噬，从而加重缺血脑损伤[29]。然而，但是随着线粒体自噬和缺血性脑卒中进一步研究，线粒体自噬是一把“双刃剑”，其在缺血性脑卒中的作用可能与脑缺血时间、缺血程度及再灌注不同病理过程密切相关，过度线粒体自噬可引起自噬性细胞损伤，加重缺血性脑卒中。因此，如何更加精准地调控BNIP3L/NIX介导的线粒体自噬，甚至应用某些药物进行干预，充分发挥BNIP3L/NIX介导的线粒体自噬在缺血性脑卒中的神经保护作用，将是我们进一步努力研究的方向。