不同商品化试剂盒定量检测肝癌晚期患者乙型肝炎病毒 DNA结果的差异

赵 佳，尚文会，田召兵，高庆娥，田秀俊

(1.西安市中心医院检验科，陕西 西安 710003；2.淄博市传染病医院检验科，山东 淄博 255067)

肝癌是世界上第六大流行和第三大致死癌症，每年造成约80万人死亡[1-2]。在引起肝癌的风险因素中，乙型肝炎病毒(hepatitis B virus,HBV)感染发挥着主要作用，全球超过50%的肝癌患者感染了HBV[3-4]。HBV有多种亚型，在我国以B、C亚型最常见。HBV介导肝癌的发病机制主要为HBV基因组整合到宿主细胞基因组中引起基因组不稳定和插入突变，且HBV基因产物具有致癌活性[5-6]。靶向HBV诱导的肝癌发生机制是非常有前景的治疗策略，可以发现潜在的肝癌预防和治疗的生物标志物和靶点。因此，对于HBV病毒的筛查、诊断和监测具有重要的临床意义[7]。

目前，除了检测HBV血清学标志物外，基于实时荧光定量聚合酶链式反应(real-time quantitative polymerase chain reaction，RT-qPCR)技术检测HBV DNA已广泛应用于临床[8]。目前，市场上有多种商品化HBV DNA超敏定量试剂盒已获国家药品监督管理局批准。由于临床上定量检测患者血清中HBV DNA时使用的试剂盒存在差异，且可能导致检测结果的差异。基于此，本研究对同一肝癌患者使用不同商品化试剂盒定量检测血清样本中HBV DNA，并通过全基因组二代测序技术分析导致检测结果差异的潜在原因，以期为HBV感染的临床诊断提供检测方法。

1 资料与方法

1.1 一般资料选择2013年10月2日淄博市传染病医院收治的1例肝癌患者为研究对象。该例患者经临床诊断为HCC 3b期[4]。2020年9月17日患者的相关临床血清及生物化学检测数据显示，患者乙型肝炎表面抗体HBsAg、HBeAb、HBcAb均呈阳性，且肝功能指标(天门冬氨酸氨基转移酶、甲胎蛋白)也异常升高，提示患者HBV 感染阳性，且肝功能受损。本研究获医院医学伦理学委员会审核批准。

1.2 试剂与仪器HBV DNA定量试剂盒分别购自罗氏诊断产品(上海)有限公司(文中简称为罗氏)和西安天隆科技有限公司(文中简称为天隆)。核酸提取仪器购自西安天隆科技有限公司，聚合酶链式反应(polymerase chain reaction,PCR)仪购自罗氏诊断产品(上海)有限公司。慧算医疗科技(上海)有限公司Illumina测序平台提供二代测序服务。

1.3 方法

1.3.1 HBV DNA定量检测2020年8月25日抽取HCC患者静脉血10 mL，3 000 r·min-1离心5 min，取上清。分别使用罗氏和天隆公司的 HBV DNA定量试剂盒于2020年8月27日、2020年9月10日、2020年9月17日、2020年11月19日对肝癌患者血清样本进行4次HBV载量检测，具体操作步骤严格按照试剂盒说明书进行。HBV载量<1×104IU·L-1表示HBV感染阴性。

1.3.2 二代测序取患者3 mL血清，由慧算医疗科技(上海)有限公司进行二代测序。以文献[9]中的HBV亚型(9种B型及15种C型)为参考建立一条通用参考序列。取肝癌患者基因组中HBV开放阅读框Precore/core区序列与通用参考序列比对，寻找差异区域。如二者序列比对后完全一致，则无突变；如二者序列比对发现有位点碱基不一致，则发生突变。应用MiSeqRepoter软件对二代测序结果进行分析，寻找患者染色体中嵌合的HBV基因组序列，并定位到具体染色体上。

2 结果

2.1 2种HBV DNA定量试剂盒检测患者血清中HBV载量比较结果见表1。罗氏HBV DNA定量试剂盒4次检测结果均为HBV感染阴性，天隆HBV DNA定量试剂盒4次检测HBV载量均>1×104IU·L-1，均为HBV感染阳性。

表1 2 种HBV DNA定量试剂盒检测肝癌患者血清中HBV载量比较

2.2 二代测序结果二代测序结果显示，患者基因组中含有人DNA读长36 417 246 bp(99%)、病毒DNA读长509 617 bp(1%)。509 617 bp病毒DNA读长中498 064 bp(98%)为HBV DNA。与通用序列比对结果显示，HCC患者基因组中HBV Precore/core区序列中未发现突变位点，患者基因组中HBV Precore/core区中P区 1 700～2 140 bp区间缺失(图1)。二代测序结果分析显示，患者多条染色体上整合了HBV基因组，其中5号染色体上HBV基因组读长3 136 bp，1号染色体上HBV基因组读长2 274 bp，10号染色体上HBV基因组读长51 bp，6号染色体上HBV基因组读长47 bp。

绿线：HBV基因组开放阅读框；灰线：通用序列；深蓝色曲线：正向测序每个区域读长数；浅蓝色曲线：反向测序每个区域的读长数。

3 讨论

二代测序技术突破了Sanger测序的局限，对于样本中的每对碱基可以达到10 000次以上的覆盖[9]。因此，在病毒相关研究方面极大地提高了检测低频率变异位点的敏感度。此外，随着计算机技术和统计学方法的发展，研究者能够更精准地了解病毒的组成结构和多样性。基于此，本研究从肝癌患者血清样本提取DNA进行二代测序以探究导致不同商品化试剂盒定量检测HBV DNA结果差异的原因。

本研究结果显示，罗氏HBV DNA定量试剂盒4次检测结果均为HBV感染阴性，天隆HBV DNA定量试剂盒4次检测结果均为HBV感染阳性，检测结果存在较大差异，故对患者血清进行二代测序以探究差异潜在的原因。本研究将肝癌患者基因组中HBV Precore/core区序列与通用序列比对结果显示，并未发现突变位点；患者基因组中HBV Precore/core区中P区 1 700～2 140 bp区间缺失，进一步分析发现该区域正是罗氏试剂盒检测的靶标位点，因此，导致罗氏试剂盒无法检测到HBV感染。

有研究发现，HBV DNA整合主要发生在病毒感染早期，为随机整合，但有相对热点的染色体，且整合发生频率很高，在HBV感染相关的肝癌患者中，85%～90%患者染色体发生了HBV DNA整合[10]。有研究表明，HBV可以通过DNA整合来影响整合位点周围基因功能，破坏或促进对细胞生长和分化至关重要基因的表达，从而促进肝细胞恶性转化[11]。本研究对HBV DNA基因整合到人染色体的嵌合位点进行分析，结果发现，患者多条染色体上整合了HBV基因组，其中5号染色体上HBV基因组读长3 136 bp，1号染色体上读长2 274 bp，10号染色体上读长51 bp，6号染色体上读长47 bp。

此外，本研究二代测序结果显示，患者基因组中含有病毒DNA读长509 617 bp(1%)，509 617 bp病毒DNA中498 064 bp(98%)为HBV DNA。这说明，本研究纳入的肝癌患者染色体上整合了HBV基因，推测HBV感染时基因组整合到宿主染色体上可能是患者血清中的HBV基因组P区序列缺失的原因，但仍有待进一步阐明。另外，对于测序结果中发现有HBV病毒存在，并不等同于有活性的HBV病毒颗粒，还需要对测序结果进行更加深入细致的分析。

综上所述，不同商品化HBV DNA定量试剂盒检测结果存在差异，可能是HBV感染时基因组整合到宿主染色体上导致的序列缺失，因此，在使用不同的检测试剂盒进行临床诊断时务必慎重。