高效液相色谱法分离及测定茶叶中的茶碱*

司晓喜，杨语喆，张雪花，刘志华，李振杰，何 沛，张凤梅，许志刚

(1 云南烟草化学重点实验室, 云南中烟工业有限责任公司技术中心，云南 昆明 650231；2 昆明理工大学 理学院，云南 昆明 650500)

茶叶品种繁多, 含有多种有益健康的有机成分、微量元素和丰富的生物碱。茶碱虽然在茶叶中的含量远小于咖啡碱，但茶碱却具有重要的药用价值，由于茶碱溶解度低，制成药剂时一般选择易溶的茶碱衍生物，如氨茶碱等。茶碱的化学名为1,5-二甲基黄嘌呤(1,5-Dimethylxanthine)[1]。茶碱类药物具有扩张支气管、抗炎、调节免疫、抑制血小板活性等作用, 是治疗哮喘的常用药物[2]。

测定茶碱的方法包括容量分析法、紫外分光光度法(UV)[3]、高效液相色谱法 (HPLC)[4-5]等。茶碱具有良好的紫外吸收, 采用UV法测定茶碱含量的报道较多。但茶碱与可可碱在270～275 nm波长处均有较强吸收, 传统UV法无法消除可可碱的干扰。在可可碱和茶碱同时存在情况下，Abuirjeie等[6]采用一阶导数光谱法和二级导数光谱法测定茶碱。与UV法的局限与导数光谱法的复杂计算相比较, HPLC法更准确、简便、快捷。茶叶中不仅含有可可碱, 还可能有咖啡因等杂质干扰, UV法无法排除相互干扰, 但HPLC法可对杂质进行分离和准确定量[7]。在样品前处理环节，较低的水浴温度不利于茶碱的释放，随着水浴温度的增加，茶碱更易于溶出[8]。本文采用沸水提取三种茶叶种的茶碱，结合高效液相色谱法进行测定，并对色谱分离条件进行了测定，所建立的分析方法能有效测定茶叶种的茶碱含量。

1 实 验

1.1 仪器与试剂

Dionex Ultimate 3000高效液相色谱仪，美国戴安公司；C18色谱柱(Venusil MP, 5 μm, 4.6 mm×250 mm)；FA2004电子天平，上海蒲春计量仪器有限公司；SHZ-D(Ⅲ)循环水式真空泵，河南省予华仪器有限公司；PS-10A超声波清洗机，深圳市洁康洗净电器有限公司；HH-34智能数显恒温水浴锅，巩义市英峪高科仪器厂。甲醇为色谱级，其它试剂为分析纯，水为娃哈哈纯净水。茶叶样品购于昆明当地超市。

1.2 分析方法

1.2.1 样品处理方法

称取干燥茶叶1.0 g，置于500 mL的圆底烧瓶中，加入60 mL煮沸的蒸馏水，并保持微沸状态15 min，趁热抽滤，滤渣用40 mL沸水重复提取2次，合并3次滤液，滤液冷却至30 ℃即可进行色谱分析[9]。

1.2.2 标准溶液的配制

准确称取5 mg 茶碱标准品，置于50 mL 的比色管中，加入甲醇溶液稀释至50 mL后超声处理1 min制得100 mg/L的茶碱标准溶液，然后逐级稀释，得到浓度分别为0.05、0.1、0.5、1、5、10、15 mg/L的标准溶液，并进行色谱分析。

1.2.3 色谱分析方法

采用Dionex Ultimate 3000高效液相色谱仪检测茶碱，色谱柱为C18柱，检测波长为270 nm，采用甲醇-水为流动相，并对流动相的组成、流速和柱温分别进行优化。定量分析时，采用外标法进行定量，采用峰面积对浓度的线性关系建立标准曲线，进一步分析实际样品种的茶碱。所有进样分析的体积均为20 μL。

2 结果与讨论

2.1 色谱条件的优化

2.1.1 流动相比例的优化

茶碱的极性较强，在C18柱上的保留弱，色谱出峰较早。流动相中甲醇和水的比例由40:60向10:90变化时，出峰时间不断增大，峰面积变化不大，但峰宽逐渐增大(如表1所示)。在流动相比例为20:80时，峰面积与出峰时间适中(如图1所示)，且目标峰与溶剂杂峰有较好的分离。因此，选择取流动相中甲醇和水的比例为20:80。

表1 流动相中甲醇-水的比例对茶碱分离的影响

图1 流动相中甲醇-水的比例优化

2.1.2 流速的优化

以比例为20:80甲醇-水为流动相，进一步优化流速。流速由0.5 mL/min向0.9 mL/min变化时，出峰时间不断减小，峰宽不断减小，峰面积也不断减小，且压强逐渐增大(如表2所示)。当流速为0.7 mL/min时，峰面积和出峰时间适中(如图2所示)，压强也不会太高。因此，选取0.7 mL/min为最优流速。

表2 流速对茶碱分离的影响

图2 不同流速对茶碱分离的影响

2.1.3 柱温的优化

进一步优化色谱柱的柱温， 柱温15 ℃向35 ℃变化时，出峰时间逐渐减小，峰宽也逐渐减小，峰面积变化不大，压强逐渐减小(如表3所示)。柱温为35 ℃时，出峰时间最佳(如图3所示)，峰面积最大，压强适中。因此，选取柱温为35 ℃。

表3 柱温对茶碱分离的影响

图3 不同柱温下茶碱的色谱分离图

2.2 分析方法的建立

流动相为甲醇-水，两者体积比为20:80，流速为0.7 mL/min，检测波长270 nm，柱温为35 ℃，进样体积均为20 μL。线性方程为Y=-0.094+1.24X，线性范围：0.05～15 mg/L，线性相关系数R2=0.9991，检出限为0.017 mg/L。

2.3 样品分析

对从市面上随机购买的三种茶叶样品铁观音，绿茶，红茶进行分析，先按照1.2.1的方法进行样品处理，再进行检测，结果在铁观音与绿茶中检出了茶碱，红茶中未检出茶碱。检出浓度在0.459～5.755 mg/L之间。

2.4 加标回收试验

为了进一步验证方法的适用性，在上述样品分析的基础上进行加标回收实验。在茶叶样品中添加一定量的茶碱标准溶液，样品的加标浓度分别为0.5 mg/L、5 mg/L、10 mg/L。按照1.2.1的方法进行样品处理，样品超声处理3 min，经 0.45 μm滤膜过滤后进样20 μL，平行测定三组。扣除本底值后的回收率在88.9%～112.2%之间，相对标准偏差(RSD)在1.1%～5.4%之间。

图4 实际茶叶样品和加标样品的色谱分析图

表4 三种茶叶样品中茶碱的测定及加标回收结果

3 结 论

建立了沸水提取-高效液相色谱法测定不同茶叶中的茶碱，对色谱分析条件进行了优化，包括流动相组成、流速和柱温。在最优的色谱条件下，测得茶叶中茶碱的浓度在0.459～5.755 mg/L之间，加标回收率在88.9%～112.2%之间，相对标准偏差在1.1%～5.4%之间。