一例ZMPSTE24基因复合杂合突变导致颅骨下颌骨皮肤发育不全B型的诊断和基因检测分析

吴丹丹，李荣，李晓南，刘倩琦，窦莉华

遗传资源

一例基因复合杂合突变导致颅骨下颌骨皮肤发育不全B型的诊断和基因检测分析

吴丹丹，李荣，李晓南，刘倩琦，窦莉华

南京医科大学附属儿童医院儿童保健科，南京 210008

颅骨下颌骨皮肤发育不全(mandibuloacral dysplasia，MAD)是一种罕见的常染色体隐性遗传疾病，主要与及基因发生变异有关。本文报道了国内首例颅骨下颌骨皮肤发育不全B型患者，主要表现为特殊面容、喂养困难、体格生长明显落后、全面的发育迟缓伴牙齿和骨骼发育异常。全外显子组家系测序结果显示患者携带基因c.743C>T (p.Pro248Leu) (dbSNP: rs121908095)与1～10号外显子缺失的复合杂合突变，经Sanger测序与定量聚合酶链反应(real-time quantitative PCR, RT-qPCR)实验检测显示，两个突变分别遗传自其表型正常的母亲与父亲。通过总结分析该例病例特点及其家系遗传规律，对于临床上难以进行明确诊断的疾病，建议进行全外显子组家系测序，辅助疾病的诊断。该病例的发现提高了临床医师对MAD疾病的认识，也为该疾病后续的遗传学研究提供新的临床资料。

基因；颅骨下颌骨皮肤发育不全B型；全外显子组测序

颅骨下颌骨皮肤发育不全(mandibuloacral dys­p­lasia，MAD)是一种罕见的常染色体隐性遗传疾病，全世界报道不足百例。患者通常表现为生长发育迟缓、下颌骨发育不全、指骨和锁骨远端进行性骨溶解和皮肤色素沉着，部分患者可能表现为类早衰特征和脂肪营养不良，颈部和躯干脂肪组织异常[1～4]。根据脂肪营养分布的方式不同，可以将MAD分为A型(mandibuloacral dysplasia type A，MADA; MIM# 248370)和B型(mandibuloacral dysplasia type B，MADB; MIM# 608612)两种，分别与与基因发生突变有关。到目前为止，国内尚未有MADB病例的报道。本研究主要描述了1例南京儿童医院儿童保健科收治MADB患儿的临床诊断以及基因检测结果，分析基因复合杂合突变的致病性，总结罕见病MADB的临床表现，并初步探索此罕见疾病的治疗方案。案例的报道扩充了MADB的临床表型，提高了临床医师对MADB疾病的认识，为后续该疾病的诊断与治疗提供新的临床资源，也为后续疾病与基因突变之间关系的理解提供了基础。

1 对象与方法

1.1 对象及临床资料收集

患者为女性，2岁，汉族，因消瘦于2021年就诊于南京医科大学附属儿童医院儿童保健科，收集患者的病史、体格检查、实验室检查、影像学检查等临床资料，并对患者及其父母进行基因检测。本研究获得南京医科大学附属儿童医院医学伦理委员会批准，其父母均签署知情同意书。

1.2 外周血DNA提取

采集患儿及父母外周EDTA抗凝血3 mL，送北京智因东方转化医学研究中心(北京全谱医学检验实验室)进行全外显子组家系测序(trio-whole exome sequencing, trio-WES)。使用血液基因组柱式中量提取试剂盒(江苏康为世纪生物科技股份有限公司)提取基因组DNA，按照试剂盒说明书进行操作。提取的DNA样本用Qubit 2.0型荧光计及0.8%的琼脂糖凝胶电泳进行质检，合格后继续后续步骤。

1.3 全外显子组测序

采用IDT公司xGen®Exome Research Panel v1.0捕获探针与DNA文库序列进行液体杂交，将目标区域DNA片段进行富集，构建全外显子文库，覆盖人基因组中19,396个基因的编码区及部分非编码区，捕获区间大小51 Mb。通过Illumina公司NovaSeq 6000系列测序仪进行高通量测序(PE150)，目标序列测序覆盖度不低于99%。

1.4 生物信息学分析

使用fastp软件对原始数据进行质控，去除接头、低质量reads等。使用Burrows-Wheeler Aligner(BWA)软件将测序序列与Ensemble参考基因组GRCh37/hg19比对；然后使用GATK软件分析出SNP、Indel；最后根据测序深度、突变质量对检测到的SNP、Indel进行过滤和筛选，得到高质量可靠的突变。使用自主开发的变异注释软件对检测到的高质量变异进行各大数据库(如dbSNP、千人基因组、ExAC、ESP等频率数据库及OMIM、HGMD、ClinVar等)的关联注释。借助Provean、SIFT、Polyphen2-HVAR、Polyphen2-HDIV、M-Cap、Revel、Mutationtaster等蛋白结构预测软件，MaxEntScan剪切位点预测软件等对其危害性进行分析，筛选出对蛋白结构可能有害影响的变异。

1.5 Sanger测序

对疑似目的基因候选变异位点设计引物：ZMPSTE24 c.743C>T正向引物5′-TATC­AAGCC­ACCAGTTTCTATCCC-3′，反向引物5′-CCTGGG­AATACCAGAGCAAGTAAG-3′，产物492 bp；应用KAPA2G Robµst HotStart PCR Kit（Sigma-Aldrich，美国）进行PCR扩增（Hema-9600基因扩增仪）。25 µL PCR反应体系：5× buffer A 5 µL，10 mmol/L dNTP 0.5 µL，10 µmol/L 上游引物 1.25 µL，10 µmol/L下游引物1.25 µL，DNA 1 µL，DNApolymerase 0.1 µL，PCR-grade water 15.9 µL。PCR反应程序：预变性95℃ 3 min，变性95℃ 30 s，退火60℃ 30 s，延伸72℃ 30 s，30个循环，再次延伸72℃1 min。PCR产物进行Sanger测序（ABI3730测序仪）验证疑似致病突变。

1.5 定量聚合酶链反应(real-time quantitative PCR, RT-qPCR)检测

采用SYBR法对正常对照样本及先证者及其父母样本进行RT-qPCR检测。以基因为内参基因，检测靶基因1～10个外显子的拷贝数。根据转录本NM_005857，利用NCBI设计引物，其序列如下：

参考基因：ALB正向引物5′-AGTGCACTTG­TT­GAGCTCGTG-3′，反向引物5′-GCAAAGCAGG­TC­TCCTTATCG-3′，产物128 bp，温度：60℃。

目标基因：ZMPSTE24-1Q-正向引物5′-GGG­ACGAGTGTCGGTGTG-3′，ZMPSTE24-1Q-反向引物5′- GGCATCTCCCACAAAGCGT-3′，产物100 bp，温度：60℃；ZMPSTE24-5Q-正向引物5′-TTCTCA­GTTTCTTGTGGTAATGTTT-3′，ZMPSTE24-5Q-反向引物5′-CAACTAATGTGAACAGCCAGG-3′，产物181 bp，温度：60℃；ZMPSTE24-10Q-正向引物5′-CTGACTGGTTGTTCTCAATGTGG-3′，ZMP­STE­24-10Q-反向引物5′-CTGCCAGGACAGAAA­T­A­ATCAGAA-3′，产物138 bp，温度：60℃。

20 μL反应体系：2×KAPA SYBR快速qPCR Master Mix通用10 μL, 10 μmol/L上游引物0.4 μL, 10 μmol/L下游引物0.4 μL，20 ng/μL DNA模板1 μL, ROX高0.4 μL, ddH2O 7.8 μL。PCR循环：95℃ 3 min，95℃3 s，60℃30 s，40个循环。按照反应体系加入样品，然后根据PCR周期使用qRT-PCR仪(ABI Step One Plus)进行扩增。采用2–ΔΔCt法进行数据分析，计算样本间的表达比。

1.6 变异致病性分析

保守性分析：蛋白序列从UniProt网站下载。利用MEGA 7序列比对软件对人类与其他物种的氨基酸序列进行比对。蛋白二级结构预测：蛋白结构域数据来自Pfam蛋白质家族数据库（http://pfam. xfam.org/），DOG2.0软件绘制蛋白质功能结构域组成示意图。根据美国医学遗传学会(American College of Medical Genetics，ACMG)遗传变异分类标准将检测到的变异分类为“致病”，“可能致病”和“意义不明确”。

2 结果与分析

2.1 MADB患者的临床表现

患儿，女，2岁，因“消瘦”就诊。患儿系第一胎第一产，出生体重2.95 kg。体格检查：体温36℃,呼吸2次/min，血压86/56 mmHg，心率100次/min，体重8.92 kg（–2.79SD），身长79.9 cm（–2.25SD），头围45.7 cm（–1.3SD），体重指数（body mass index，BMI）13.97 kg/m2（–1.54SD）。右侧下肢皮肤咖啡斑约2 cm×4 cm，前囟已闭，头发稀疏，脱发，外耳耳廓畸形，下颌后缩，嘴呈“o”型，腹部平软，全身皮下脂肪菲薄，四肢肌张力正常，双手手指畸形、末节短小（图1）。诊室内配合，存在共同关注，可执行简单指令，1岁半独走，理解力欠佳。

实验室检查：血生化提示尿酸高539 μmol/L，血常规、甲状腺功能、空腹胰岛素、血液遗传代谢检查未见异常。影像学检查：头颅核磁提示两侧枕骨形态小，颅缝间见多发缝间骨(图2，A和B)；X片提示指端形态异常，末节指骨小，右足踇趾趾骨短小，左侧正常（图2，C和D）；双下肢X片、CT平扫提示双侧股骨、胫骨、坐骨、髂骨提示多发骨皮质吸收改变（图2，E和F）；脊柱、胸廓、髋关节、膝关节未见异常。0～6岁发育筛查测验：发育商为68，智能发育分数为76；中文早期语言与沟通发育量表：总体语言相当于15～16月。24 h膳食评估提示：总能量、蛋白质、脂肪、碳水化合物摄取不足，微量元素：铁、锌、硒、铜、锰摄入不足，钙、钠、钾镁摄取过多；维生素E、B1、B2、烟酸；摄入过少。

图1 患者颅面部及手部特征

A：患儿正面外观：眼球突出、下颌后缩，嘴呈“o”型，牙齿发育不全；B：患儿侧面外观：下颌后缩、双耳耳廓轻度畸形、头发稀疏，脱发；C：患儿双手末节短小。

图2 患者影像学检查结果

A：头颅核磁成像结果显示颅缝间见多发大小不等卵石样缝间骨；B：枕骨形态小，人字缝异常增宽；C：手足X片结果显示指端形态异常，末节指骨小；D：右足踇趾趾骨短小，左侧正常；E：双下肢X片结果显示双侧股骨上段及胫骨上段骨髓腔骨质密度不均匀；F：双下肢CT平扫显示双侧股骨胫腓骨上段前面及背侧可见对称性骨皮质异常，呈吸收样表现。

2.2 基因结果分析

全外显子组测序结果提示患儿基因(NM_005857)存在c.743C>T (p.Pro248Leu)与1～10号外显子缺失的复合杂合变异。进一步的Sanger测序和RT-qPCR检测结果显示：突变c.743C>T来源于母亲(图3A)，而1～10号外显子缺失突变来源于父亲(图3B)。患者父母健康，因此，检测的基因复合杂合突变符合常染色体隐性遗传(AR)疾病的发病机制，先证者及其家系成员表型及基因型符合共分离。突变c.743C>T为dbSNP中已报道的致病变异突变，突变会导致第248位氨基酸的替换(p.Pro248Leu)。Pro248在不同物种中高度保守(图4A)，且位于基因编码蛋白FACE1的Peptidase_M48结构域(图4，B和C)，氨基酸的替换可能会影响FACE1催化功能，对蛋白功能造成损伤。1～10号外显子缺失突变尚未被报道，预测会导致蛋白表达水平的下降。根据ACMG制定的遗传变异分类标准与指南进行致病性分析：突变c.743C>T可评级为“可能致病(likely pathogenic)”变异(PS1 + PM1 + PM2 + PP3：PS1，c.743C>T与已确定的致病变异相同；PM1，位于已知无良性变异的关键功能域；PM2，低频变异；PP3，多软件预测致病)，而1～10号外显子缺失突变可评级为“可能致病(Likely pathogenic)”变异(PVS1+PM2：PVS1，基因功能可能丧失；PM2，正常对照人群中未发现的变异)。结合患者的临床表型，且没有其他表型相关的突变被检测到，推测基因符合杂合突变导致患者疾病的发生。

图3 ZMPSTE24基因复合杂合变异的验证结果

A：Sanger测序验证先证者及其父母的基因c.743C>T变异；B：实时定量PCR验证先证者及其父母的基因1～10号外显子缺失变异。

图4 ZMPSTE24基因c.743C>T(p.Pro248Leu)位点分析

A：核酸保守性预测。p.Pro248Leu位于蛋白高度保守区域，突变后可能对蛋白功能造成损伤。B：蛋白二级结构展示。Peptidase_M48_N，也叫作CAAX prenyl protease 1, N-terminal，代表CAAX前阴性蛋白酶1N端5个跨膜α-片断域；Peptidase_M48，也叫作CAAX prenyl protease 1，与FACE1蛋白是同系物，该区域代表FACE1蛋白主要的催化区域。C：蛋白跨膜结构预测。FACE1是跨膜蛋白，p.Pro248Leu突变位于核内。

3 讨论

MAD是一种罕见的常染色体隐性遗传疾病，全世界报道不足百例。目前，MADB国内尚未报道与基因有关。基因位于人1号染色体(1q34.2)的短臂上，是一种编码核纤蛋白酶A的锌蛋白酶[3, 5]的基因，该基因突变会导致脂肪细胞核膜的重要组成成分核纤层蛋白的结构异常，加速成熟脂肪细胞的凋亡，从而引起脂肪萎缩[6]。与MADA相比，MADB临床表现出现更早、更严重、进展更快[7]。MADB临床表现为下颌骨和锁骨发育不全、末端趾骨破裂、骨质溶解、色素沉着、皮肤萎缩和广泛性脂代谢不良，并伴有代谢综合征，如胰岛素抵抗、葡萄糖不耐受、糖尿病和高甘油三酯血症[8]。目前尚未建立MADB的临床诊断标准，基因检测可以在大多数情况下明确MADB的诊断[9]。本例患儿与MADB典型的临床特征高度一致，值得注意的是，本例患儿还具备其他临床特征，例如，外耳廓耳廓畸形，耳廓结构简单；另外患儿伴有智力发育、大运动发育、语言发育落后；患儿虽然没有发现高胰岛素血症，但出现了高尿酸血症，这些是以往未认识到的临床特征。患儿检验结果显示并未出现胰岛素抵抗、高胰岛素血症的情况，另外患儿也未出现骨质溶解解，这可能均与儿童年龄较小有关，有待继续随访观察。现将已报道的MADB患者的表型与本例患者表型总结(表1)。

MADB的治疗需要个体化对症、支持性治疗，需要儿科医生、骨科医生、内分泌医生、皮肤科医生、营养师和其他医疗保健专业人员的团队协作，进行系统、全面的计划患儿的治疗方案，包括饮食、运动、降脂药和降糖药等多方面的配合。目前还没有临床实验来确定药物治疗的最佳使用来治疗MAD的代谢并发症。本例患儿出生后身高、体重增加缓慢，且营养评估提示患儿总能量、蛋白质、脂肪、碳水化合物摄取不足，同时伴有高尿酸血症，仅仅提供高能量营养以实现追赶生长可能会增加代谢综合征的风险，但是儿童必须保证足够的能量摄入以保证生长发育的需要，因此可尝试给予含中链脂肪酸奶粉喂养，同时，由于可溶性植物纤维有明显降低血三酰甘油和尿酸的作用，因此食物中应含充足的纤维素。针对此例患儿，建议换用富含中链脂肪酸的短肽高能量配方粉，同时制定高能量、高蛋白、高膳食纤维食谱，摄入纤维素的量为(年龄+ 5) g/天[10]。1个月后患儿体重增加1.1 kg，尿酸由539 μmol/L降至309 μmol/L，血糖、血脂、胰岛素仍正常。这表明营养干预对于MADB儿童的生长追赶是有效的，并且可以降低高尿酸。随后患儿接受下颌骨内延长器植入术和下颌骨内延长器调整术，住院52天期间给予患儿鼻饲和或流食喂养，由于饮食摄入量受限，患儿体重未增长，目前处在术后恢复期。

表1 已报道的MADB患者的表型与本例患者表型比较

+：存在；–：不存在；NA：未报道。

根据此例MADB患儿，本研究提供了MADB新的临床特征，包括智力、运动、语言发育落后，高尿酸血症，耳廓畸形，枕骨小，双侧股骨、胫骨、坐骨多发骨皮质吸收等，并对MADB儿童的生长追赶及尿酸代谢异常进行了营养治疗上的初步尝试并取得较好的治疗效果，对于未来如何更好地指导MADB儿童进行适度的追赶，预防远期高尿酸血症、高脂血症和胰岛素抵抗，对于儿科医生来说是个挑战，需要进行长期的追踪随访。该案例提示人们，对于基于临床无法诊断疾病的患者，应及时进行基因检测，尽早对患儿进行明确诊断并给予有效治疗，更好地改善患者的临床结局。患者详细的临床信息与基因检测结果，也为该疾病后续的遗传学研究提供了基础。

[1] Simha V, Garg A. Body fat distribution and metabolic derangements in patients with familial partial lipodystro­phy associated with mandibuloacral dysplasia., 2002, 87(2): 776–785.

[2] Shen JJ, Brown CA, Lupski JR, Potocki L. Mandibuloacraldysplasia is caused by homozygosity for the R527H mutation in lamin A/C., 2003, 40(11): 854–857.

[3] Novelli G, Muchir A, Sangiuolo F, Helbing-Leclerc A, D'Apice MR, Massart C, Sbraccia P, Federice M, Lauro R, Tudisco C, Pollatta R, Scarano G, Dallapiccola B, Merlini L, Bonne G. Mandibuloacral dysplasia is caused by a mutation in LMNA-encoding lamin A/C., 2002, 71(2): 426–431.

[4] Agarwal AK, Kazachkova I, Ten S, Garg A. Severe mandibuloacral dysplasia-associated lipodystrophy and progeria in a young girl with a novel homozygous Arg527Cys LMNA mutation., 2008, 93(12):4617–4623.

[5] Agarwal AK, Fryns JP, Auchus RJ, Garg A. Zinc metallo­proteinase, ZMPSTE24, is mutated in mandibuloacral dysplasia., 2003, 12(16): 1995–2001.

[6] Lattanzi G, Benedetti S, Bertini E, Boriani G, Mazzanti L, Novelli G, Pasquali R, Pini A, Politano L. Laminopathies: many diseases, one gene. Report of the first Italian meeting course on laminopathies., 2011, 30(2): 138–143.

[7] Miyoshi Y, Akagi M, Agarwal AK, Namba N, Kato- Nishimura K, Mohri I, Yamagata M, Nakajima S, Mu­shiake S, Shima M, Auchus RJ, Taniike M, Garg A, Ozono K. Severe mandibuloacral dysplasia caused by novel com­pound heterozygous ZMPSTE24 mutations in two Japanese siblings.t, 2008, 73(6): 535–544.

[8] Haye D, Dridi H, Levy J, Lambert V, Lambert M, Agha M, Adjimi F, Kohlhase J, Lipsker D, Verlose A. Failure of ossification of the occipital bone in mandibuloacral dysplasia type B., 2016, 170(10): 2750–2755.

[9] Brown RJ, Araujo-Vilar D, Cheung PT, Dunger D, Garg A, Jack M, Mungai L, Oral EA, Patni N, Rother KI, von Schnurbein J, Sorkina E, Stanley T, Vigouroux C, Wabitsch M, Williams R, Yorifuji T. The diagnosis and management of lipodystrophy syndromes: a multi-society practice guideline., 2016, 101(12): 4500–4511.

[10] Li XZ, Huang XJ. Congenital and acquired lipodystrophies., 2015, 30(20): 1533-1537.

李秀珍, 黄新疆. 先天性及获得性脂肪营养不良. 中华实用儿科临床杂志, 2015, 30(20): 1533–1537.

Diagnosis and genetic analysis of a case with mandibuloacral dysplasia type B due to compound heterozygous mutations of thegene

Dandan Wu, Rong Li, Xiaonan Li, Qianqi Liu, Lihua Dou

Mandibuloacral dysplasia (MAD) is a rare autosomal recessive disorder, mainly caused by pathogenic variants of theandgenes. In this study, we reported the first case of a patient with type B cranial and mandibular dysplasia in China. The patient presented with distinctive facial features, feeding difficulties, significant physical retardation, and overall developmental delay with abnormal tooth and bone development. Trio-whole exome sequencing analysis showed that the patient carried compound heterozygous mutations of c.743C>T (p.Pro248Leu) (dbSNP: rs121908095) and the loss of exons 1-10 of thegene. Sanger sequencing and real-time quantitative PCR (RT-qPCR) showed that these two mutations were inherited from the patient’s phenotypically normal mother and father, respectively. By summarizing and analyzing the characteristics of this case and the pedigree of the family, we suggested that trio-whole-exome sequencing could be performed to assist in the diagnosis of diseases that are difficult to be diagnosed definitively based on clinical phenotypes. The publication of this case has improved clinicians’ understanding of MAD disease and provide new clinical information for the subsequent genetic study of this disease.

; mandibuloacral dysplasia type B; whole exome sequencing

2022-07-25;

2022-09-06;

2022-09-15

吴丹丹，硕士，主治医师，研究方向：儿童发育行为。E-mail: nantongwudandan@163.com

李荣，硕士，副主任医师，研究方向：儿童发育与营养。E-mail: 15850780062@163.com

10.16288/j.yczz.22-117

(责任编委: 周红文)