太行鸡源芽孢杆菌的分离鉴定及对雏鸡生长性能的影响

张晓雪，王 斌，刘丽丽，薛晓阳，刘永相，闫兆阳，石玉祥⋆

（1.河北工程大学生命科学与食品工程学院 056038；2.华裕农业科技有限公司 057150）

饲料中低剂量的抗生素添加可有效提高家禽的饲料转化率、降低死淘率、促进家禽的生长，进而提高生产效率。然而，抗生素的滥用和过度使用也带来严重的负面影响，如产生多重耐药菌，对公共健康造成潜在的威胁。我国农业农村部194号公告规定，自2020年7月1日起，饲料生产企业停止生产含有促生长类药物饲料添加剂(中药类除外)的商品饲料[1]。为了保证家禽养殖业的健康发展，寻找优良的替抗产品已成为目前亟需解决的一项问题。

芽孢杆菌是一类呈杆状、遍布于自然环境和动植物体内的革兰阳性菌。研究发现，芽孢杆菌不仅在外界压力下可以形成芽孢，而且也可以分泌多种功能性代谢产物[2,3]。芽孢杆菌通过核糖体途径或非核糖体途径合成的抗菌活性物质抑菌效果好，不易产生耐药性等特点，多种芽孢杆菌已被收录于《饲料添加剂目录》[4]。然而，目前市售的芽孢杆菌质量参差不齐，部分芽孢杆菌分泌的毒素可导致腹泻、呕吐等症状，还有的芽孢杆菌自身携带耐药基因，可能造成一定的传播风险[5]。另外，芽孢杆菌一般来源于植物或者土壤，其在宿主体内的定植特性和益生特性还有待于评估。

太行鸡（河北柴鸡）是河北省首个通过国家畜禽遗传资源委员会鉴定的地方鸡品种，其具有抗病力强、耐粗饲和蛋肉品质鲜美等特点，越来越受市场青睐。在调研过程中发现，农户散养的太行鸡通过自由觅食和简单饲喂等保持了良好的体型和寿命，鸡只产蛋和蛋质均良好，未发生疫病和意外死亡情况。研究表明，动物源性益生菌的分离和使用更易在动物体内完成定植和发挥作用[6,7]。因此，本文旨在以太行鸡为研究对象，筛选出优良的鸡源益生芽孢杆菌，为商品鸡的健康养殖提供更为安全有效的饲用益生菌制剂。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 菌株与实验动物

21株芽孢杆菌分离于邯郸地区农户散养太行鸡的新鲜粪便（每只鸡饲养均超过3年）。指示菌大肠杆菌ATCC 25922（Escherichia coli ATCC 25922）、肠炎沙门菌ATCC 13076（Salmonella enteritidis ATCC 13076）及金黄色葡萄球菌ATCC 29213（Staphylococcus aureus ATCC 29213）购自于中国普通微生物菌种保藏管理中心。60只1日龄海兰灰公雏鸡由华裕农业科技有限公司提供。

1.1.2 主要试剂与仪器

细菌基因组DNA提取试剂盒购自于天根生化科技（北京）有限公司，2×含染料Taq预混PCR反应体系购自于北京康润诚业生物科技有限公司，胆盐、芽孢染色液购自于北京索莱宝科技有限公司，蜡样芽孢杆菌选择性琼脂基础及添加剂购自于青岛高科技工业园海博生物技术有限公司，TSB、TSA、MHA培养基购自于赛默飞世尔科技（中国）有限公司。基础日粮购自于河北联心饲料有限公司。

1.2 芽孢杆菌的分离

称取新鲜的太行鸡粪便2g，置于含10mL PBS的试管中，充分震荡混匀后80oC水浴20min。取粪便悬液100μL用涂布棒均匀涂布于蜡样芽胞杆菌选择培养基上，37oC培养48h。在选择培养基平板上挑取不同大小和形状的单菌落，经纯化得到单克隆，并将得到的单克隆依次编号。

1.3 芽孢杆菌染色

将分离的菌株接种于TSA平板上，37oC培养24h。在平板上刮取适量的菌落溶于500μL PBS溶液中，随后按照芽孢染液试剂盒进行芽孢染色。即制成适当厚度的细菌涂片，经火焰固定、染色后，使用光学显微镜观察。

1.4 抑菌活性测定

采用双层琼脂平板法对已分离的芽孢杆菌进行抑菌活性测定。即取5μL过夜培养的芽孢杆菌培养液于TSA平板中，使之形成一个直径约为0.5cm的接种点，37oC培养48h。将指示菌的菌悬液浓度调整至0.5个麦氏比浊度，按照100倍稀释添加至高压冷却至50oC左右MHA琼脂中，充分摇匀后缓慢地覆盖到待测芽孢杆菌的TSA平板上，晾干后置于37oC恒温培养箱中培养24h。观察双层琼脂平板上抑菌圈的大小。

1.5 耐受性检测

取适量的HCl配制pH为3.0和5.0的酸性TSB培养基，以检测芽孢杆菌的耐酸性；取适量的猪胆盐配制成浓度为0.3%和0.5%的TSB培养基，以检测芽孢杆菌的胆汁耐药性。将有抑菌活性的芽孢杆菌培养液按照1/100稀释于上述培养基中，37oC恒温孵育2h。分别取100μL孵育0h和2h的菌液进行10倍梯度稀释，并均匀涂布于TSA平板上，37oC培养24h后进行计数。每组进行3个重复，通过统计处理前后芽孢杆菌的活菌数计算在不同pH和胆盐浓度下的存活率。

1.6 16S rRNA基因测序

将上述分离的芽孢杆菌的单克隆接种于TSB培养基中，置于37oC恒温摇床中过夜培养（200rpm），6000rpm离心2min收集菌体。参考天根生化科技（北京）有限公司的试剂盒说明书提取芽孢杆菌的基因组DNA。以提取的基因组DNA为模板进行16S rRNA基因的PCR扩增，扩增引物为16S rRNA基因通用引物，引物序列为27F（5’-AGAGTTT GATCCTGGCTCAG-3’）和1492R（5’-GGTTACCTT GTTACGACTT-3’）。20μL的PCR反应体系为2×Taq PCR StarMix (Dye) 10μL，上游引物和下游引物（10μM）各0.4μL，DNA模板1μL，双蒸水补足至20μL。PCR的反应条件设置为：95℃，5min（预变性）；95℃，30s（变性），55℃，30s（退火），72℃，90s（延伸），30个循环；72℃，7min（终延伸）。PCR产物委托北京博迈德基因技术有限公司进行测序，测序的结果拼接后在NCBI的BLAST上进行序列相似性比对，最后使用MEGA X构建系统发育进化树。

1.7 动物安全性评价

将1日龄健康的海兰灰品系公雏鸡分为对照组和芽孢杆菌实验组，每组20只。饲养条件参考《海兰饲养管理手册》。将培养的芽孢杆菌菌液收集菌体后使用生理盐水重悬2次，按照108CFU/g饲料分别给实验组的雏鸡进行饲喂。每天观察实验组和对照组雏鸡的粪便情况和生长情况，雏鸡饲喂至8日龄，称重。

1.8 数据统计及可视化

采用SPSS 26.0软件对实验数据进行统计分析，其中两组数据的显著性差异进行Student’t-检验。利用GraphPad Prism 9.0对数据进行可视化处理，利用iTOL工具 (https://itol.embl.de/)进行发育树可视化。

2 结果与分析

2.1 芽孢杆菌的筛选

从14份邯郸市农户散养的太行鸡新鲜粪便中共分离到21株芽孢杆菌，分别编号为HUE2021101-HUE2021121。部分芽孢染色结果如图1所示。染色后芽孢着绿色，细菌着红色。

图1 鸡源芽孢杆菌染色

2.2 体外抑菌试验

采用双层琼脂法对21株太行鸡源芽孢杆菌的体外抑菌效果进行初步筛选，其中HUE2021105、HUE2021108、HUE2021119和HUE2021120四株芽孢杆菌对大肠杆菌ATCC 25922、金黄色葡萄球菌ATCC 29213和肠炎沙门菌ATCC 13076均存在不同程度的抑菌效果，其余芽孢杆菌几乎无抑菌活性，部分芽孢杆菌的抗菌效果如图2所示。

图2 双层琼脂平板法验证芽孢杆菌的抗菌活性

2.3 耐酸及耐胆盐特性

上述四株芽孢杆菌在不同pH和胆盐浓度条件下的生长情况如图3所示，四株芽孢杆菌在不同pH和胆盐存在的条件下存活率均高于40%，其中HUE2021105和HUE2021120在pH为3和0.5%胆盐的条件下存活率超过60%，表明其具备较好的耐酸和耐胆盐特性。

图3 4株鸡源芽孢杆菌在不同pH和不同胆盐浓度下的存活情况

2.4 鸡源芽孢杆菌的鉴定

将上述耐酸和胆盐较好的鸡源芽孢杆菌HUE2021105和HUE2021120进行基因组DNA提取、PCR扩增和测序后，得到的16S rRNA序列提交至NCBI进行BLAST比对，鉴定得到两株枯草芽孢杆菌属细菌，与已上传的枯草芽孢杆菌16S rRNA基因相似度超过99%。从GenBank中选取其它芽孢杆菌的16S rRNA基因序列构建其系统发育进化树，结果如图4所示，HUE2021105和HUE2021120与Bacillus subtilis亲缘关系最近，故将其分别命名为Bacillus subtilis HUE2021105和Bacillus subtilis HUE2021120。

图4 基于16S rRNA基因序列构建鸡源芽孢杆菌的系统发育树

2.5 雏鸡使用安全性及生长状况

自1日龄起，按照参考《海兰饲养管理手册》进行雏鸡的正常饲喂，其中实验组的雏鸡日粮中分别添加108CFU/g的HUE2021105和HUE2021120。通过对比观察实验组和对照组雏鸡的粪便形状和生长状况可知，HUE2021105和HUE2021120均未导致雏鸡发生腹泻和生长不良，其消化器官未发生损伤。如图5所示，通过8日龄雏鸡的体重增长情况发现HUE2021120饲喂的雏鸡增长相比于对照组差异显著（p =0.0019），同时组内雏鸡生长的均匀度更好，表明其具备一定的促生长能力。

图5 鸡源芽孢杆菌HUE2021120对雏鸡生长的影响 (＊＊ p < 0.01)

3 讨论

动物的肠道表面定植着丰富多样的微生物群体，它们之间彼此联系，又相互制约，共同维持了宿主的肠道稳态[8,9]。组成稳定的肠道菌群有益于宿主的发育、代谢、免疫调节及营养吸收[10-14]。然而，当肠道菌群发生异常变化时可能导致宿主出现疾病，比如动物早期的抗生素干预会严重影响宿主的健康，并可对其造成长期的不良影响[14-16]。

在家禽养殖过程中，抗生素的使用可以有效控制和预防家禽细菌感染性疾病，如沙门菌感染[17]。然而，无效或过量的抗生素使用可能产生严重的残留、毒性，也导致了细菌耐药基因的传播[18]。益生菌作为一种动物活制剂的使用可为减少抗菌药物的使用提供很好的思路。研究发现，宿主和肠道菌群之间有着紧密的相互选择关系，而益生菌的同源性可显著增强其益生功效[19]。基于此，本文通过筛选出优良的鸡源益生菌，以期获得在规模化养殖过程中达到替抗保健的目的。芽孢杆菌具有良好的抗逆特性，通过分泌多种活性物质来提高饲料利用率，发挥定植抗性，也可以调控宿主的肠道菌群，近年来受到青睐[3]。例如郝庆红从鸡的盲肠内容物中筛选出枯草芽孢杆菌JM-11，能够抑制致病性大肠杆菌导致的腹泻和促进乳酸菌的生长[19]。肖瑀轩等从我国地方品种散养鸡的盲肠中分离出暹罗芽孢杆菌CML548，通过体外试验表明其具有抑制病原菌的特性[20]。本文通过采集散养太行鸡的新鲜粪便，共分离出4株具有较好抑菌活性的芽孢杆菌，可显著抑制大肠杆菌、肠炎沙门菌和金黄色葡萄球菌的生长。

动物胃肠道环境是影响益生菌生长和发挥作用的重要因素之一，口服益生菌需经过胃到达肠道后才能发挥益生作用。鸡胃的pH在3左右，鸡小肠内胆盐的浓度在0.03%～0.3%范围内，本研究筛选的4株鸡源芽孢杆菌均可在体外模拟的胃酸环境和胆盐浓度存活。其中HUE2021105和HUE2021120的存活率较高。经过体内试验后的实验结果同样证实了HUE2021120可以进入体内发挥出较好的益生效果。

4 结论

本研究从邯郸地区农户散养的太行鸡粪便中分离获得21株芽孢杆菌，经过体外抑菌能力、耐酸耐胆盐生物学特性及16S rRNA基因鉴定和动物使用安全性评价，获得一株抑菌能力较好且具有促生长能力的枯草芽孢杆菌HUE2021120，该菌株具有优良的益生特性，有望成为饲用益生菌制剂的候选菌株。