注射用舒尼铂(冻干粉)的制剂安全性初步研究*

徐红花，廖伟，刘瑞，杨坤芬，廖文平

(1.云南省药物研究所,云南 昆明 650111;2.云南省中药和民族药新药创制企业重点实验室,云南 昆明 650111)

铂类抗癌药物在临床用于恶性肿瘤的化疗，其中顺铂和卡铂是目前临床上广泛使用的抗癌药物，也是治疗许多肿瘤的首选药物[1-2];据统计，目前40%～80%的肿瘤患者都接受了含有铂类药物的化疗[3-4].已上市的铂类抗癌药物均为2价铂的化合物，因其在消化道的化学环境下稳定性较差，易发生化学反应而降解，口服给药无抗癌作用[5]，故临床上一般用静脉给药制剂.

注射用舒尼铂(冻干粉)为昆明贵金属研究所、中科院上海药物研究所和云南白药集团共同研发的一种新型铂类抗癌候选药物，其原料药也是2价铂类化合物，是以舒铂为先导化合物经过结构修饰而来，同时组合了卡铂的部分结构.前期药学研究表明，注射用舒尼铂(冻干粉)的水溶性和溶液的稳定性好，对胃癌和肺癌人肿瘤裸小鼠皮下移植瘤疗效显著，因此有望作为注射剂开发为治疗胃癌和肺癌的新型铂类抗肿瘤药物.

研究通过局部毒性、免疫原性(过敏性)和异常毒性试验，考察注射用舒尼铂(冻干粉)作为静脉注射给药的制剂安全性，为1.1类新药申报提供安全性依据.

1 材料与方法

1.1 药品与试剂

注射用舒尼铂：冻干粉，云南省药物研究所中试基地产品，规格：50 mg/瓶，以舒尼铂原料药计.阴性对照为氯化钠注射液(0.9%)；溶媒为葡萄糖注射液(5%)，昆明南疆制药有限公司产品.阳性对照为卵清白蛋白，Sigma公司产品；白蛋白(鸡蛋)，SIGMA-ALORICH公司产品.

1.2 仪器

Allegra 64R台式高速冷冻离心机为美国BECKMAN COULTER公司产品；Thermo 1500全波长酶标仪为芬兰Labsystems公司产品；GHP-9160隔水式恒温培养箱为上海一恒科技有限公司产品；TC-30K电子天平为美国双杰兄弟(集团)有限公司常熟市双杰测试仪器厂产品；MSS-4S动物麻醉机为上海任谊生物科技有限公司产品；0-150 mm电子开关数显卡尺为桂林广陆数字测控股份有限公司产品.

1.3 实验动物

溶血试验采用普通级新西兰家兔，邳州市东方养殖有限公司，生产许可证号：SCXK(苏)2014-0005.血管刺激性试验采用SD大鼠，生产许可证号：SCXK(京)2016-0006；异常毒性试验采用SPF级KM种小鼠，生产许可证号：SCXK(京)2016-0011；主动全身过敏性试验和被动皮肤过敏性试验采用SPF级Hartley豚鼠，生产许可证号：SCXK(京)2016-0011，均来源于北京维通利华实验动物技术有限公司.动物使用福利伦理审查机构和编号：云南省药物研究所实验动物管理和使用委员会，动(伦)IACUC-2017-52(溶血试验)、动(伦)IACUC-2018-25(大鼠重复毒性试验)、动(伦)IACUC 2018-04(异常毒性)、动(伦)IACUC-2018-16(主动全身过敏试验)和动(伦)IACUC-2018-21(被动皮肤过敏试验).

1.4 试验方法[6-9]

1.4.1 溶血试验(体外)

家兔耳中央动脉采血，去除纤维蛋白原，用氯化钠注射液制备2.0%红细胞悬液，按表1依次加入药品、红细胞悬液、阴性和阳性对照品，在(37±0.5)℃温箱中温育3 h，温育结束，肉眼观察各试验管的溶血反应，并取上清液0.1 mL于545 nm波长测定吸光度，计算溶血率(%).温育后红细胞全部下沉，上清液为无色澄明，且溶血率<5%，表明无溶血发生；否则为溶血或红细胞凝聚.

表1 溶血试验加样表Table 1 Table of sample addition for hemolysis test

1.4.2 血管刺激性试验

整合到大鼠重复给药毒性试验中观察，将动物分为溶媒对照组、注射用舒尼铂(冻干粉)3.0、6.0 mg/mL和12.0 mg/mL浓度组，每组32只动物，雌雄各半，每3 d尾静脉注射给药1次，共12次，每次给药容积为9.0 mL·kg-1，末次给药后恢复6 w，每天肉眼观察动物给药局部的刺激反应情况.

1.4.3 异常毒性试验

将10只动物分为注射用舒尼铂(冻干粉)低剂量组(190.0 mg/kg)和高剂量组(286.0 mg/kg)，每组5只，3雌2雄，各组以每只动物0.5 mL的给药体积，匀速并在4～5 s内完成尾静脉注射.48 h内每天称重1次,观察动物一般体征2次；观察结束后解剖动物，观察各脏器、器官的体积、颜色和质地等情况.若48 h内动物无异常反应和死亡，判定为符合规定.

1.4.4 主动全身过敏性试验

将40只动物分为阴性对照组(5%葡萄糖注射液)，阳性对照组(10.0 mg/mL卵清白蛋白)，注射用舒尼铂(冻干粉)低、中、高剂量组(3.0、6.0 mg/mL和12.0 mg/mL)，每组8只，雌雄各半.以每只动物0.5 mL的体积腹腔注射致敏3次，隔日1次，末次致敏后第14和21天每组分别取4只(雌雄各2只)动物按每只1.0 mL静脉注射激发.激发后观察3 h内动物的过敏反应症状，并根据过敏反应症状进行结果评价，过敏反应症状评分和评价标准见表2.

表2 全身致敏性评价标准Table 2 Criteria for evaluation of systemic sensitization

1.4.5 被动皮肤过敏性试验

制备抗体血清阶段：将10只动物分为5组，每组2只，雌雄各半，组别和给药剂量同1.4.4内容，阳性对照组给予10.0 mg/mL的白蛋白(鸡蛋)，共给药5次，隔日1次.末次给药第10天采血，分离血清冷冻保存.

被动致敏及激发阶段：另取30只动物分为5组，组别同制备抗体血清阶段，每组6只，雌雄各半.将制备的不同稀释度抗体血清皮内注射于对应组动物背部(左上、左下、右上、右下分别为1∶2、1∶4、1∶8、1∶16)致敏，4 h后一次快速静脉注射对应浓度药液与0.5%伊文思蓝按1∶1的混合液1.0 mL激发.30 min后牺牲动物，测量皮肤内层的蓝斑大小，当蓝斑直径大于5 mm判为阳性.

2 结果

2.1 溶血试验

温育180 min后肉眼观察，阳性对照管溶液不分层，均为红色澄明液体；注射用舒尼铂(冻干粉)各管与阴性对照管比较无明显肉眼差异，上清液均为澄明无色，下层为红色，均无凝聚；各管溶血率<5%.结果见表3.

表3 注射用舒尼铂(冻干粉)溶血性试验结果Table 3 Results of the hemolytic test of suniplatin injection(lyophilized powder)

-表示管中溶液上层澄明无色，下层红色，无凝聚；+表示管中溶液红色澄明，无凝聚.

2.2 血管刺激性试验

3.0 mg/mL 浓度组动物未见异常，6.0 mg/mL和12.0 mg/mL浓度组部分动物尾部中下段在第3次给药后开始逐渐出现脱屑、皮肤隆起、渗出液和结痂的刺激反应症状，停药2～3 d可逐渐恢复.

2.3 异常毒性试验

低、高剂量组动物给药后48 h内观察无异常体征和动物死亡；给药后第1天低、高剂量组大部分动物体重略下降，给药后第2天恢复增长；观察结束后解剖各脏器未见异常.动物体重变化情况见图1和图2.

图1 雌鼠体重变化情况 图2 雄鼠体重变化情况Fig.1 Changes in the weight of female mice Fig.2 Changes in the weight of male mice

2.4 主动全身过敏性试验

阳性对照组全部动物在第14和21天激发后，均出现不同程度的痉挛和潮式呼吸、步态不稳、搔鼻、排尿、竖毛、喘息、不安宁和跳跃的过敏反应症状，4 min内全部动物死亡，全身致敏性评价为过敏反应极强阳性，阴性和注射用舒尼铂(冻干粉)各剂量组动物未见任何过敏反应症状发生，全身致敏性评价为阴性.结果见表4.

表4 激发给药后过敏反应评分及分级结果Table 4 The results of anaphylaxis score and grading after challenge administration

2.5 被动皮肤过敏性试验

阳性对照组动物背部各血清稀释度皮肤内层的蓝斑直径均大于5 mm，皮肤被动过敏反应为阳性.阴性对照组和注射用舒尼铂(冻干粉)各剂量组背部皮肤内层均未见蓝斑，皮肤被动过敏反应均为阴性(结果见表5).

表5 蓝斑直径Table 5 Diameter of locus coeruleus

3 讨论

药物冻干工艺对临床用药具有十分重要的意义，与液体剂型相比，冻干粉具有易于长期运输保存，确保无菌无热源，能够进行水分重新吸收，利于恢复药物活性等优点，这也是冻干粉针剂得到广泛应用的原因[10-11]，但冻干粉针剂作为无菌药品的常用剂型，采用非最终灭菌的无菌生产工艺，生产过程仍存在多因素的影响，相对于其他剂型属于高风险剂型[12].因此，注射用舒尼铂(冻干粉)作为1.1类新药开发，在非临床研究的初期开展全面的制剂安全性评价研究非常重要.

研究结果显示，注射用舒尼铂(冻干粉)在最大溶解浓度12.0 mg/mL及以下不会引起家兔体外红细胞溶血，静脉注射对小鼠无异常毒性反应，也不会引起豚鼠产生过敏反应，而整合到大鼠重复给药毒性试验中的血管刺激性试验，观察到注射部位(尾部)及周围有脱屑、皮肤隆起、渗出液和结痂的刺激症状，表明注射用舒尼铂(冻干粉)在6.0 mg/mL及以上浓度多次给药会产生血管刺激性，但试验中未进行刺激性评分和组织病理学检查，而组织病理学检查又是血管刺激性试验结果判断的主要依据[13-14]，故认为以上结果不足以准确评价注射用舒尼铂(冻干粉)的血管刺激性.下一步将采用家兔开展血管刺激性试验，依据血管刺激性评分标准，结合组织病理学检查结果进行综合评价.