无创产前筛查中孕妇年龄对胎儿游离DNA的影响

李博洁，谢梅花，龚燕飞

岳阳市中心医院检验科，湖南 岳阳 414000

近些年来，通过分析孕妇血浆中的胎儿游离DNA(cell-free fetal DNA，cffDNA)来检测21三体、18三体、13三体综合征等胎儿染色体非整倍体异常的无创性产前检测(non-invasive prenatal testing，NIPT)技术在临床上得到广泛应用。一般认为，cffDNA是一段长度约为150 bp、双链且高度片段化的DNA片段，从凋亡或被母体系统降解的胎儿细胞以及胎盘滋养层细胞中释放入母体血液循环，在孕期持续存在，分娩2 h后消失[1]。由于技术局限，合格的NIPT检测要求分析所需的样本中cffDNA浓度比例需高于4.0%，否则可能会导致假阴性或者检测失败情况的出现[2]。现有的证据已经证实影响cffDNA浓度的主要因素有孕妇孕周[3]、体质量指数(body mass index，BMI)[4]、孕妇的自身情况(如患有活动性自身免疫性疾病和有使用低分子肝素、降压药、抗生素的用药史)[5-6]等。其他潜在因素方面，孕妇年龄对cffDNA浓度的影响一直以来是各研究的争论点。有数据表明cffDNA与孕妇的年龄呈负相关趋势[7]；然而，也有研究者指出cffDNA浓度并不受孕妇的年龄的影响[8]。另一项由北京协和医院主持的NIPT前瞻性实验中，通过检测研究2 241例低危孕产妇人群的cffDNA浓度，也证实了NIPT技术在低龄孕妇(＜35岁)和高龄孕妇(≥35岁)中能取得相似的检测效力[9]。为了证实孕妇年龄到底是否与cffDNA浓度存在相关性，本研究以近年来在我院进行NIPT检测的孕妇为研究对象，对检测结果中的外周血cffDNA浓度和孕妇年龄等数据综合进行统计学分析，旨在探明孕妇年龄因素对cffDNA浓度的影响，以期为NIPT技术的在高龄孕产妇中的临床实施提供参考依据。

1 资料与方法

1.1 一般资料收集2020年10月至2021年9月期间在岳阳市中心医院行NIPT检测且符合以下条件的884例孕妇的个人一般资料以及疾病、用药史等临床资料。(1)纳入标准：孕周在10～21周、体质量指数(BMI)＜35 kg/m2的孕妇样本。(2)排除标准：孕妇孕期内有活动性自身免疫性疾病、低分子肝素、降压药或抗生素用药史。本研究经过医院伦理委员会批准，所有孕妇均于其胎儿染色体非整倍体无创产前检测申请单上签署姓名，孕妇方承诺提供的个人资料真实可靠，并授权院方处理本检测涉及的血液样品。

1.2 NIPT检测抽取孕妇外周静脉血5～8 mL于Cell-Free DNA BCT streck真空采血管中，血浆分离后分装至已编好号的离心管中，通过达瑞生物提供的核酸提取试剂盒(磁珠法)对血浆进行高速离心后洗涤纯化、DNA洗脱和浓度测定，提取的DNA浓度应大于0.05 ng/μL以用于下一步文库构建，然后通过文库构建试剂盒(磁珠法)对提取的DNA经过末端修复、DNA片段末端连接接头和PCR扩增DNA片段以构建DNA文库，经Qubit荧光定量仪进行文库质检定量，建库DNA浓度应大于2 ng/μL以用于上机测序；按照胎儿染色体非整倍体21三体、18三体和13三体检测试剂盒(半导体测序法)准备上机文库及退火，借助DA8600测序平台进行上样测序分析，检测所得序列经与人参考基因组比对，根据测序样本的唯一比对reads数目(有效数据量)的定位，计算得出标准化的21、18、13染色体异常风险值(Z值)。当所测样品满足质量控制数据标准(有效数据量＞3 M，cffDNA浓度＞5%)判定结果合格，否则重测。

1.3 统计学方法应用SPSS22.0统计学软件对样品数据进行分析，Graphpad Prism 6.0软件对数据进行统计绘图。计数资料以例数或率表示，计量资料符合正态分布，以均数±标准差(±s)表示，组间比较采用t检验；数据相关性通过Spearman相关性分析来验证。以P＜0.05表示差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 孕妇年龄分布884例孕妇的年龄18～43岁，平均妊娠年龄(30.9±4.5)岁。其中，年龄段在29岁的孕妇83例，在整体样本中占比最高，达9.4%。而≥35岁的高龄孕产妇共98例，在总体中的占比达11.1%(图1)。

图1 孕妇的年龄分布

2.2 孕妇年龄与外周血cffDNA浓度的相关性经NIPT检测发现，884例孕妇样本外周血cffDNA的浓度为6.1%～49.7%，平均(25.3±7.1)%。其中21岁孕妇的cffDNA浓度最高，平均(29.2±3.8)%，而36岁孕妇外周血平均cffDNA浓度最低，仅(21.6±6.9)%。经Spearman相关性分析结果显示，cffDNA浓度与孕妇年龄呈负相关(r=-0.105，P＜0.05)，见图2。将孕妇样本按照年龄分为低龄组(＜35岁)和高龄组(≥35岁)，两组样本的平均cffDNA浓度分别为(25.7±7.1)%和(24.1±7.0)%，与低龄组相比，高龄组孕妇的cffDNA浓度有所降低，差异有统计学意义(t=2.679，P＜0.05)，见图3。

图2 孕妇年龄与cffDNA浓度的相关性

图3 低龄组与高龄组孕妇的cffDNA浓度

3 讨论

三胎政策的开放背景下，临床上高龄孕产妇出现频率增加，年龄因素越来越影响着优生优育政策的有效实施。高龄孕产妇作为出生缺陷遗传筛查的高风险人群，是广大临床妇儿工作者需要面临的严峻挑战。目前临床上被广泛应用的产前筛查和诊断技术手段的选择中，通过高通量测序法来检测孕妇外周血中cffDNA遗传序列的NIPT技术有效规避了传统有创性检测对孕妇及胎儿的介入性损伤所带来的自然流产、早产等风险[10]，操作方面简便、安全且无创，使得该项检测技术在孕产妇中的接受度也更高。

研究表明，孕妇年龄因素可能是影响NIPT检测效力的一个潜在因素，年龄增加有可能导致染色体异常疾病检出率的降低[11]；此外，cffDNA在外周血总游离DNA的存在比例(即cffDNA浓度比例)作为NIPT技术的关键质量控制因素，很大程度上决定了检测的成功率和结果的准确性[12]，然而研究者们对于高龄妊娠对cffDNA浓度比例是否存在影响的认知方面，一直存在争议。

为了探究年龄因素与cffDNA浓度比例的相关性，本研究收集岳阳市中心医院自2020年10月至2021年9月以来实施NIPT检测的孕妇临床资料，根据影响cffDNA浓度比例的主要干扰因素条件筛选样本后进行数据汇总和统计学分析，结果显示孕妇平均年龄达到了(30.9±4.5)岁；高龄孕产妇的总体占比达到了11.1%，这与DENG等[13]于2012年公布的仅只有7.4%的中国高龄孕产妇率相比显著增加结论相等，而这或许与城镇化发展、经济水平提高和生育政策的开放造成的影响分不开。此外，本研究证实了年龄因素对cffDNA浓度比例的影响，在院内进行NIPT检测且纳入本研究筛选条件的所有孕妇样本中，测得cffDNA浓度比例随着年龄增长总体呈下降趋势，并且高龄孕产妇组(≥35岁)的外周血cffDNA比例较低龄组(＜35岁)也有所降低。综上所述，孕妇年龄的增加会导致外周血cffDNA比例的降低，临床医生需格外注意高龄孕产妇的无创产筛检测报告里的cffDNA浓度值。本研究尚且存在局限性，由于NIPT项目在本院内的开展时间尚短，暂未能跟踪随访到所有样本的妊娠结局。是否孕产妇的高龄因素会通过降低cffDNA浓度比例而对NIPT技术的目标疾病检出率存在有影响呢？这需要作为后续的研究目标得到进一步验证。