绿色木霉Tv－1511及其生物有机肥对盐碱地小麦、玉米生长及其产量的影响

霍雪雪，张豪，黄艳华，李哲，郑泽慧，郝永任，王庆玲，郭凯，2

(1. 齐鲁工业大学(山东省科学院)生物研究所，山东 济南 250014；2. 山东师范大学环境与生态研究院，山东 济南 250358)

近年来，全球土壤的盐渍化程度不断加剧，如何有效利用盐碱地已经成为全世界的热点问题[1]。盐碱地的共性是土壤有机质和营养成分低、理化性状不良、微生物活动受限、无法维持植物健康生长，严重影响农业的可持续发展[2]。施用生物有机肥可以提高土壤肥力，改善土壤结构，降低毛细水的运移速度，减少水分的无效蒸发，有明显的抑制返盐效果。施用生物有机肥还能增加土壤有效钙的含量，同时微生物分解有机质产生的有机酸也能活化土壤吸附的钙，增强土壤中吸附钠的置换，导致脱盐脱碱。因此，开发一种盐碱地区适宜的生物有机肥，是加速盐碱地土壤改良的有效途径。生物有机肥发挥作用的核心是具有特定功能的微生物。针对盐碱地的特点，筛选能够耐受盐碱环境的功能微生物，是决定生物有机肥有效性的关键。

木霉菌(Trichodermaspp.)是广泛分布于自然界中的有益真菌，是工业上重要的酶制剂生产菌株，是土壤环境中有毒物质的降解菌株，是农业生产中重要的植病生防菌株，在工农业生产领域及环境保护领域均有着广泛应用[3]。研究发现，木霉可以通过诱导抗氧化酶活性[4]、降低盐胁迫导致的脂质过氧化[5]、增强植物的光合作用[6]等方式来提高植物耐盐性。此外，木霉还可以提高植物在盐碱环境下的抗病能力[7]。绿色木霉是兼具促生和生防功能的有益真菌，可定殖于植物根际形成共生体，一定程度上增加植物根系养分吸收利用率、促进植物生长、提高产量及诱导植物增强抗逆性等[8]。但目前筛选获得的耐盐碱绿色木霉菌株种类有限，进一步筛选出具有抗逆、促生和增产等多方面功能的绿色木霉具有重要意义。

因此，本研究对本单位前期筛选获得的一株绿色木霉(Trichoderma viride)Tv－1511 进行耐盐性分析，探究其提高植物耐盐性的机制，同时结合Tv－1511 生物有机肥对滨海盐碱地作物产量的影响，评价其应用于提高植物耐盐和盐土改良的可行性，以期为木霉类生物有机肥的推广应用和农业可持续发展提供理论依据，为滨海盐碱地开发提供技术支持。

1 材料与方法

1.1 供试材料

供试菌株:绿色木霉菌(Trichoderma viride)Tv－1511，齐鲁工业大学(山东省科学院)生物研究所保存。

供试作物:小麦品种济麦22，由山东省农业科学院作物研究所选育；玉米品种华农138 号，购自北京华农伟业种子科技有限公司。

供试培养基:马铃薯葡萄糖琼脂(PDA)固体培养基、马铃薯葡萄糖(PDA)液体培养基。

田间示范试验地:土壤有机质含量为0.61%～1.01%，且高钾低氮低磷；pH 值偏碱性，高于8.0；盐分含量0.3%～0.6%，属于中重度盐渍化土。

供试木霉生物有机肥:由金星(日照)农业科技有限公司提供，按生物有机肥[以尾菜和玉米秸秆为原料，经过高温发酵生产而得，彻底腐熟后含水量≤30%、有机质≥45%、全氮4%、全磷(P2O5)4%、全钾(K2O)2%、硫酸锌(ZnSO4)0.05%、游离氨基酸(amino acid)1%]干重的5%添加木霉固体发酵物制成，木霉孢子数量为2×108cfu/g。

1.2 试验方法

1.2.1 绿色木霉Tv－1511 耐盐性评价试验 用打孔器在菌落边缘取直径为5 mm 的绿色木霉Tv－1511 菌块，分别接种于NaCl 浓度为0、100、200、300 mmol/L 和400 mmol/L 的PDA 平板上，倒置于28℃恒温培养箱中培养，每天测定Tv－1511 生长圈的半径，扫描生长圈的形态和大小。

1.2.2 小麦水培试验 取小麦种子进行催芽育苗，待长出3 片叶时移至水培装置。采用正交试验设计，分别以不同浓度(0、100、200 mmol/L)NaCl 溶液和不同浓度(0、105cfu/mL)Tv－1511 孢子液两两组合，共计6 个处理，分别记为CK: 对照(0 mmol/L NaCl)；Tv－1511:105cfu/mL 孢子液处理；S: 100 mmol/L NaCl 处理；S＋Tv－1511: 100 mmol/L NaCl 和105cfu/mL 孢子液处理；SS: 200 mmol/L NaCl 处理；SS ＋Tv－1511: 200 mmol/L NaCl 和105cfu/mL 孢子液处理。每处理3 盆，每盆小麦4 株，重复3 次。

分别于处理0、7、14、21 d 进行生长指标(株高、根长、叶长、叶宽)测定；处理21 d 后进行生物量(干重、鲜重)、光合色素含量(叶绿素a、叶绿素b、类胡萝卜素)、过氧化氢(H2O2)含量和抗氧化酶活性(SOD、POD、CAT)的测定。

1.2.3 木霉生物有机肥大田试验 试验在黄河三角洲农业高新技术产业示范区中进行，2018年10月至2019年6月种植小麦， 2019年6月至2019年11月种植玉米。以不施肥(CK)和常规施肥(CF)为对照，设置木霉Tv－1511 生物有机肥替代15%、30%和100%化肥处理，分别记为T1、T2 和T3。随机区组排列，重复3 次。小区面积160 m2。所有处理按当地施肥方式所需养分统一施肥，常规管理。

1.3 测定项目与方法

1.3.1 生长指标 株高:测定茎基部到叶片自然伸展时的最高处；叶长:测定第3 片叶(从上向下)叶基到叶尖的长度，不含叶柄；叶宽:测定第3片叶(从上向下)上与主脉垂直方向上的最宽处；茎粗:用游标卡尺测定距茎基部2 cm 处的直径；根长:测定主根长度。

1.3.2 生物量 取植株鲜样用蒸馏水冲洗干净，然后用吸水纸吸干表面水分，将植株分为地上和地下两部分，分别称鲜重；将地上和地下部分开放入烘箱中105℃烘15 min，之后65℃烘干至恒重，称干重。

1.3.3 光合色素含量 每株从上至下选取第3片完全展开叶进行光合色素测定。取新鲜叶片0.05 g用95%乙醇中避光萃取48 h，至叶片发白。取萃取液以95%乙醇稀释5 倍后分别于665、649 nm 和470 nm 波长下进行比色，计算叶绿素a、叶绿素b 和类胡萝卜素的含量[9]。

1.3.4 过氧化氢含量和抗氧化酶活性 过氧化氢含量采用过氧化氢测定试剂盒测定(A064－1，比色法)。SOD 活性采用总超氧化物歧化酶(TSOD)测试盒(A001－1，羟胺法) 检测，POD 活性采用过氧化物酶(POD)测试盒(A084－3，比色法，南京建成科技有限公司) 检测，CAT 活性采用过氧化氢酶(CAT)测试盒(A007－1，可见光法) 检测。以上试剂盒均购自南京建成科技有限公司，试验过程严格按照试剂盒说明书操作。

1.3.5 产量 小麦成熟后，每小区随机选取3 个1 m2样方全部收获，脱粒晒干后称重计产，然后换算成含水量13%的单位面积产量。玉米成熟后，每小区随机选取长势均匀的2 垄玉米收获，脱粒晒干后称重计产，然后换算成含水量为14%的单位面积产量。

1.4 数据处理与分析

所有试验数据使用Microsoft Excel 2010 进行统计，采用SPSS 20.0 软件进行统计及显著性分析。

2 结果与分析

2.1 绿色木霉Tv－1511 耐盐性分析

由图1 看出，不同浓度NaCl 处理对木霉Tv－1511 菌株生长有不同程度的影响。随着NaCl 浓度的升高，Tv－1511 生长速率呈降低趋势，且随着培养时间延长，影响效果也呈降低趋势。当NaCl浓度为400 mmol/L 时，培养24、48、72、96 h 和120 h 的对照菌落半径是处理菌株的2.61、2.26、2.06、1.92 倍和1.87 倍，Tv－1511 表现出较强的耐盐性。

图1 不同浓度NaCl 溶液对绿色木霉Tv－1511 菌株生长的影响

2.2 绿色木霉Tv－1511 对不同浓度盐胁迫下小麦幼苗生长的影响

由图2 看出，正常生长条件下(0 mmol/L NaCl)，绿色木霉Tv－1511 处理小麦各生长指标均高于CK，呈现一定的生长优势；盐胁迫条件下，Tv－1511 处理小麦生长优势更为明显。正常生长条件下Tv－1511 处理21 d 时小麦株高、根长、叶长和茎粗是CK 的1.20、1.22、1.17 倍和1.21 倍，而在200 mmol/L NaCl 胁迫下，Tv－1511 处理21 d时小麦幼苗相应生长指标是未处理组的1.25、1.38、1.29 倍和1.33 倍，其中根长增加最为显著。因此，绿色木霉Tv－1511 可以促进小麦生长，且盐胁迫下效果更为显著。

图2 Tv－1511 孢子液对盐胁迫下小麦生长的影响

分析绿色木霉Tv－1511 对盐胁迫下小麦生物量的影响，结果(表1)表明，各盐浓度下Tv－1511 处理小麦植株鲜重和干重均显著高于各自未处理组(P<0.05)，且促进效果与生长指标一致。与未用Tv－1511处理的小麦相比，Tv－1511处理小麦植株地下部鲜重和干重分别增加27.03%和28.57%，而200 mmol/L NaCl 处理后，相应的增长量变为39.54%和38.46%。因此，绿色木霉Tv－1511 可以促进小麦生物量积累，而且盐胁迫条件下表现出更明显的优势。

表1 Tv－1511 孢子液对盐胁迫下小麦生物量的影响

2.3 绿色木霉Tv－1511 对不同浓度盐胁迫下小麦叶片光合色素含量的影响

由图3 看出，随着盐浓度的增加，Tv－1511 处理组和未处理组小麦叶片的光合色素含量均有所下降，但相同浓度NaCl 处理下，Tv－1511 处理组的光合色素含量均显著或极显著高于未处理组(P<0.05 或P<0.01)。其中，Tv－1511 处理组的叶绿素a 含量是未处理组的1.93 倍(100 mmol/L NaCl)和2.33 倍(200 mmol/L NaCl)；叶绿素b 含量是未处理组的1.88 倍(100 mmol/L NaCl)和2.14倍(200 mmol/L NaCl)；类胡萝卜素含量是未处理组的1.76 倍(100 mmol/L NaCl)和2.18 倍(200 mmol/L NaCl)。因此，绿色木霉Tv－1511 可以通过增加小麦叶片的光合色素含量来促进光合作用，并且在盐胁迫下这一效果更为明显。

图3 Tv－1511 孢子液对不同浓度盐胁迫下小麦光合色素含量的影响

2.4 绿色木霉Tv－1511 对不同浓度盐胁迫下小麦幼苗H2O2含量和抗氧化酶活性的影响

由图4 看出，在正常生长(0 mmol/L NaCl)条件下，Tv－1511 处理组表现出与未处理组同等水平的H2O2含量；盐胁迫处理后，H2O2含量均增加，且相同浓度NaCl 处理下，Tv－1511 处理的H2O2含量极显著低于未处理组(P<0.01)。与未用Tv－1511处理的小麦幼苗相比，Tv－1511 处理组的H2O2含量分别降低23.10%(100 mmol/L NaCl)和36.48%(200 mmol/L NaCl)。

图4 Tv－1511 孢子液对盐胁迫下小麦H2O2含量和抗氧化酶活性的影响

正常生长条件下，Tv－1511 处理组和未处理组小麦幼苗的抗氧化酶活性无显著性差异；盐胁迫处理后，Tv－1511 处理组小麦的CAT、SOD 和POD 活性显著或极显著高于未处理组(P<0.05或P<0.01)。在正常生长条件下，Tv－1511 处理组小麦CAT、SOD 和POD 活性是未处理组的1.13、1.08倍和1.08倍；而在200 mmol/L NaCl 胁迫下，相应的抗氧化酶活性是未处理组的1.26、1.31 倍和1.36 倍。因此，绿色木霉Tv－1511 可以通过增强抗氧化酶活性提高小麦耐盐性。

2.5 绿色木霉Tv－1511 制备的生物有机肥对小麦、玉米生长及产量的影响

2.5.1 对小麦和玉米生长的影响 由图5 看出，与不施肥CK 和常规施肥CF 相比，T1、T2 和T3处理均能促进小麦和玉米生长。其中，T1、T2、T3处理小麦、玉米(拔节期)株高分别是CK 的1.17、1.21、1.13 倍和1.41、1.64、1.29 倍，是CF 的1.07、1.10、1.03 倍和1.20、1.39、1.10 倍。相比各施肥处理，T2 处理的生长优势最为显著(P<0.05)。与CF 相比，T2 处理小麦、玉米的茎粗、叶长、叶宽分别增加4. 58%、 31. 64%、 17. 88% 和21.14%、25.33%、27.52%。因此，木霉Tv－1511 生物有机肥可以促进盐碱地小麦和玉米生长，且以生物有机肥替代30%化肥处理促生效果最为显著。

图5 不同施肥处理对小麦和玉米生长的影响

2.5.2 对小麦和玉米产量的影响 由表2 看出，与不施肥CK 相比，T1、T2、T3 处理小麦产量分别增加43.99%、62.90%和35.45%；与常规施肥CF相比，T1、T2、T3 处理小麦产量分别增加18.95%、34.57%和11.90%。

木霉Tv－1511 生物有机肥施肥处理也显著提高玉米产量(表2、图6)。与CK 相比，T1、T2和T3 处理分别增产61.74%、71.76%和42.00%；与CF 相比，T1、T2 和T3 处理分别增产31.54%、39.69%和15.48%，差异均达显著水平(P<0.05)。因此，木霉Tv－1511 生物有机肥可以增加盐碱地小麦和玉米产量，且以替代30%化肥的增产效果更为显著。

图6 不同处理收获的玉米果穗

表2 不同施肥处理小麦和玉米产量

3 讨论与结论

高盐环境会严重影响植物的生长发育，是造成植物减产或死亡的主要因素之一。利用植物与根际土壤微生物的共生关系，可促进植物对生物和非生物的耐受性，缓解盐胁迫对植物生长造成的不利影响[10]。木霉菌是自然界广泛分布的多功能有益真菌，是土壤微生物的重要组成部分。研究发现，木霉菌可以通过调控植物根系发育[11]、改变植物激素水平[12]、改善植物营养状况[13]等减轻盐胁迫对植物的不利影响，诱导植物产生对盐胁迫的耐受性。本研究中，前期筛选获得的一株绿色木霉Tv－1511 的孢子液对小麦生长和生物量均有一定的促进作用，且盐胁迫下效果更为显著。此外，木霉还可以降低叶绿素的分解，增强植物在盐胁迫下的光合作用。Oljira等[6]研究发现，木霉可以缓解盐胁迫对小麦光合作用的抑制，提高小麦叶片的叶绿素含量和净光合速率；Soliman 等[14]研究发现，木霉提高盐胁迫下南瓜叶片的光合色素含量，增强光合作用强度。本试验结果显示，绿色木霉Tv－1511 能够显著增加盐胁迫条件下小麦叶片的叶绿素a、叶绿素b和类胡萝卜素含量，说明Tv－1511 可以缓解盐胁迫对光合作用的抑制，提高盐胁迫条件下小麦的光合作用强度。

盐胁迫导致植物细胞中活性氧和自由基的大量积累，对细胞造成严重的氧化损伤。植物的抗氧化系统可以清除这些自由基和活性氧，促进细胞对盐胁迫的耐受性。赵忠娟等[15]研究发现，木霉可以通过增加SOD、CAT 和POD 等抗氧化酶的活性，有效缓解盐胁迫对植物的膜脂过氧化程度；Boamah 等[4]研究发现，除酶促防御系统外，木霉还可以通过激活非酶促抗氧化系统(抗坏血酸、还原性谷胱甘肽、类黄酮、生物碱、类胡萝卜素)来清除过多的活性氧，使植物抗氧化能力和耐盐性显著增加。与上述研究结果一致，本研究发现绿色木霉Tv－1511 处理小麦幼苗盐胁迫条件下的H2O2含量明显低于对照，抗氧化酶(SOD、POD和CAT)活性明显高于对照，说明Tv－1511 能够通过抗氧化防御途径增强小麦的耐盐性。本研究结果对开发和利用耐盐高效木霉菌株具有重要的理论和生产意义。

木霉对植物的解盐促生作用与植物生长基质有密切的关系。在缺少基质的情况下，木霉会受到土壤理化性质的影响，很难成功定殖并大量繁殖。有机肥是改良盐碱地的优良材料，木霉菌能够以有机肥为载体，快速占据优势生态位，有效发挥解盐促生作用[16，17]。肥料主要有无机、有机、生物三大类，在农业生产中，既能单独施用，也能混合施用。田家明等[18]对比了基施不同量生物有机肥(0、3 000、6 000、9 000 kg/hm2)对盐胁迫下花生生长发育的影响，发现有机肥用量为6 000 kg/hm2时促生增产效果最佳；赵政等[19]研究发现，与等养分的100%化肥相比，普通有机肥或木霉孢子液灌根配施会降低番茄产量，而木霉生物有机肥与化肥配施，可显著提高番茄品质和产量，长期施用还可提高土壤微生物数量、改善土壤肥力；Jiang 等[20]研究发现，生物有机肥可以显著改善盐碱地的微生物区系，但过多的肥料施入，特别是化肥，反而会抑制微生物的活性。因此，有必要对盐碱地施肥种类与数量，比如生物有机肥与化肥的配比等开展研究。于亚楠等[21]对木霉生物有机肥与化肥应用于滨海盐土的最优配比进行了探究，发现60%木霉生物有机肥与40%化肥配施为最优；李瑞霞等[22]研究发现，减施25%化肥同时配施木霉生物有机肥，可通过调控土壤养分有效性、土壤微生物区系和土壤酶活性来改善盐土的可耕种性，从而提高番茄的产量和品质；王欢[23]研究发现，减施30%化肥同时配施木霉生物有机肥能够缓解土壤盐胁迫，增加土壤有机质和有效磷含量，改善盐土黄瓜果实品质。本研究发现，与不施肥和常规施肥相比，Tv－1511 生物有机肥替代15%、30% 和100%化肥均可显著促进玉米、小麦的生长及产量的增加，说明养分并不是影响盐碱地植株生长发育的唯一因素，这与王福友等[24]的研究结果一致。其中，Tv－1511 生物有机肥替代30%化肥的促生增产效果最佳，这一比例的生物有机肥与化肥协同作用，显著促进了小麦和玉米在盐碱地中的生长，提高产量。本研究结果可为木霉类生物有机肥的推广应用和农业可持续发展提供理论依据。