基于高通量测序分析黔中金荞麦内生菌及其根际土壤微生物多样性

张涛，周思旋，唐远江，陶小艳，卢昱希，赵宇，史开志，李婷，杨粤黔

(贵州省农业科学院畜牧兽医研究所，贵州 贵阳 550005)

植物内生菌是指生活在健康植物组织内并不引起明显病害症状的一类菌，包括真菌、细菌、放线菌和卵菌，几乎在所有植物组织中都存在[1]。在与植物长期共存中内生菌会产生与宿主植物类似的生理活性次级代谢产物，在很大程度上丰富了人类药用宝库[2]。在农业生产生活中，药用植物内生菌不仅可提高宿主自身抗性，还可用来开发动物饲料或添加剂，或开发兽药等[3]。目前，药用植物内生菌的研究主要集中在其次级代谢产物上，对其内生菌的分离主要通过体外培养法纯化得到，由于部分菌株无法在人工培养基上生长[4，5]，即使使用多种培养基对菌株进行分离，也无法保证寄生于植物体内全部的内生菌都能被分离出来。高通量测序技术为全面分析植物组织中微生物多样性提供了便利，可准确反映植物内生微生物的种类组成和比例，已广泛应用于微生物多样性及群落分析等研究[6]。

黔中金荞麦(Fagopyrum dibotrysQian Zhong)是贵州省畜牧兽医研究所以贵州黔中地区野生金荞麦为原始材料驯化而成的牧草新品种[7]，是一种高蛋白牧草，具有产量高、适口性好、营养价值高等特点[8，9]。同时，也是一种价值高的中草药，含苷类、萜类以及黄酮类等多种化学成分，具有清热解毒、活血化瘀、健脾利湿等功效。目前，黔中金荞麦以药饲兼用、绿色无污染的优质饲草资源被广泛应用在仔猪和肉鸡等畜禽饲料中作为减抗替抗饲料添加制品[10，11]。本研究以黔中金荞麦为研究对象，采用高通量测序技术对其内生菌16S rDNA V3－V4 和ITS1 区扩增系列进行分析，揭示黔中金荞麦内生菌及根际土壤微生物的组成和丰度，为进一步对黔中金荞麦资源的可持续利用及其内生菌优质菌株开发提供可靠菌种来源。

1 材料与方法

1.1 试验材料

于2021年7月分别采集贵州省黔西市(27°4′0″N，105°49′4 E，海拔1 330 m)、贵州省贵阳市龙洞堡(26°31′49″N，106°47′26″E，海拔1 100 m)、花溪区麦坪镇(26°25′49″N， 106°20′26″E，海拔1 100 m)3 个地点的新鲜健康黔中金荞麦样本各4 株，所有植株均为整株采挖，采集对应植株根际土壤，迅速带回实验室，24 h 内进行处理。

1.2 试验方法

1.2.1 样本表面消毒 将不同地区新鲜健康的黔中金荞麦冲洗干净并晾干，根、茎剪成0.5～1.0 cm 的小段，叶片剪成0.5 cm × 0.5 cm 小方块。组织块表面消毒:0.1%吐温表面活化3～5 min，无菌水冲洗3 次；75%乙醇浸泡3 min，无菌水冲洗3次，用无菌滤纸吸干表面水分；再用70%乙醇＋3% H2O2混合液消毒，根茎5～7 min，叶1～2 min，无菌水冲洗3 次，无菌滤纸吸干，置于50 mL 无菌离心管中，－80℃保存备用。

1.2.2 基因组DNA 提取及PCR 扩增 采用十六烷基三甲基溴化铵(CTAB)方法对样本的基因组DNA 进行提取，利用琼脂糖凝胶电泳对DNA 进行检测，取适量于离心管中，无菌水稀释至1 ng/μL。利用16S rRNA V3－V4 区引物341F(5′－CCTAYGGGRBGCASCAG－ 3′)、 806R (5′ － GGACTACNNGGGTATCTAAT－3′)对内生细菌进行PCR 扩增，反应体系:2×Phusion master mix 15 μL，引物(2 μmol/L)各1.5 μL，DNA 模板10 μL，ddH2O 2 μL；扩增程序:98℃1 min；98℃10 s，50℃30 s，72℃30 s，共30 个循环；72℃10 min。利用ITS1-1F 区引物ITS1-1F-F(5′-CTTGGTCATTTAGAGGAAGTAA-3′)、 ITS1-1F-R ( 5′-GCTGCGTTCTTCATCGATGC-3′)对内生真菌进行PCR 扩增。反应体系:5×FastpfuBuffer 4 μL，引物(5 μmol/L)各0.8 μL，dNTPs(2.5 mmol/L)2 μL，DNA 聚合酶0.4 μL，DNA 模板1 μL，ddH2O 补加至20 μL；扩增程序:95℃3 min；95℃30 s，55℃30 s，72℃45 s，共30 个循环；72℃10 min。采用TruSeq®DNA PCRFree Sample Preparation Kit 构建文库，经Qubit 和Q－PCR 定量和文库检测合格后，使用NovaSeq 6000 上机测序。高通量测序由北京诺禾致源科技股份有限公司完成。

1.2.3 测序数据处理与分析 将测试得到的原始数据进行拆分、拼接、过滤及校正后得到优化序列。再经去除嵌合体序列，得到最终的有效数据。

利用UPARSE 对所有样品的全部有效数据进行聚类，默认以97%的一致性将序列聚类成为分类操作单元( operational taxonomic units，OTUs)，选取出现频率最高的序列作为OTUs 代表序列，采用Mothur 方法与SILVA138 中SSUrRNA数据库进行物种注释分析。基于OTUs 聚类结果，利用Qiime 软件进行样本复杂度分析(alpha diversity)，计算Observed species、Chao 1、Shannon、Simpson 及ACE 指数。

2 结果与分析

2.1 黔中金荞麦内生菌及根际土壤微生物OTUs分析

经Illumina NovaSeq 测序，内生细菌按照97%相似性进行聚类注释得到OTUs 1 675 条；内生真菌注释得到OTUs 2 045 条。各样品序列统计结果见表1。茎叶、根及根际土壤间细菌共有OTUs为87 个，特有OTUs 分别为12、38 个和1 213 个；茎叶、根及根际土壤中真菌共有OTUs 为233 个，特有OTUs 分别为358、141 个和812 个(图1)。

表1 各样品序列统计

图1 细菌(左)和真菌(右)OTUs 分布韦恩图

2.2 Alpha 多样性分析

由图2 可知，随着测序深度的增加，所有样本OTUs 数量先增加后逐渐趋于平缓，说明样本量充足，测序数据合理，能够较好地反映黔中金荞麦内生菌菌群信息。Chao 1 和ACE 指数用来估计群落中生物丰富度；Simpson 和Shannon 指数用来描述物种均匀度和多样性。由表2 可知，黔中金荞麦茎叶内生细菌Chao1 指数、ACE 指数、Simpson指数、Shannon 指数分别为117.01、130.14、0.37、1.13，均低于根部；而真菌的Chao 1 指数、ACE 指数、Simpson 指数、Shannon 指数分别为652.71、656.73、0.92、5.30，均高于根部。表明黔中金荞麦茎叶的内生细菌群落丰富度及多样性低于根部，真菌的丰富度及多样性则比根部的高。根际土壤微生物的Alpha 多样性各指数均高于黔中金荞麦茎叶和根部，说明土壤中微生物种类最为复杂、数量最多。根据Observed species 指数直观观测到的细菌物种数目为根际土壤>黔中金荞麦根>黔中金荞麦茎叶，真菌物种数目为根际土壤>黔中金荞麦茎叶>黔中金荞麦根。

图2 样本中细菌(左)和真菌(右)稀释曲线图

表2 黔中金荞麦内生菌及根际土壤微生物的Alpha 多样性指数

2.3 内生菌群落结构组成

由表3 可知，黔中金荞麦茎叶和根中内生细菌群落在门水平上主要为蓝藻菌门(Cyanobacteria)、变形菌门(Proteobacteria)、放线菌门(Actinobacteriota)和厚壁菌门(Firmicutes)，其在茎叶中的相对丰度分别为75.23%、14.07%、5.35%、4.94%，在根中的相对丰度分别为63. 83%、34.01%、0.64%、0.30%。根际土壤中主要有变形菌门、放线菌门和厚壁菌门，相对丰度分别为36.12%、13.52%、1.41%。真菌群落门水平要包括子囊菌门(Ascomycota)和担子菌门(Basidiomycota)，在茎叶中的相对丰度分别为67.45% 和23.07%，在根中的相对丰度分别为35.77%和33.53%，根际土壤中的相对丰度分别为37.10%和14.12%。

表3 黔中金荞麦内生菌及根际土壤微生物门水平相对丰度(%)

由表4 可知，在属水平上，黔中金荞麦茎叶中内生细菌有变形菌门未知属(unidentified＿Chloroplast)、蓝藻菌门未知属(unidentified＿Mitochondria)、痤疮丙酸杆菌(Cutibacterium)、葡萄球菌属(Staphylococcus)，相对丰度均大于3%，其中变形菌门未知属相对丰度最高，占所有菌属的75.23%，被鉴定出来的优势属为痤疮丙酸杆菌(5.03%)。黔中金荞麦根中内生细菌有变形菌门未知属(unidentified＿Chloroplast)、蓝藻菌门未知属(unidentified＿Mitochondria)和Ellin6067 属，相对丰度分别为63.82%、32.48%和3.08%。根际土壤中内生细菌主要有赫黄嗜盐囊菌属(Haliangium)、鞘氨醇单胞菌属(Sphingomonas)、Dongia属、芽单胞菌属(Gemmatimonas)、Ellin6067 属、MND1 属，相对丰度均大于1%，其中赫黄嗜盐囊菌属相对丰度最高，占所有菌属的2.96%。黔中金荞麦茎叶真菌群落属水平上主要为枝孢菌属(Cladosporium)、腥掷抱菌属(Tilletiopsis)、间座壳属(Diaporthe)、织球壳菌(Plectosphaerella)、刺盘孢属(Colletotrichum)，其中枝孢菌属相对丰度最高，占所有菌属的16.10%，为茎叶中的优势菌属。黔中金荞麦根内生真菌群落属水平上主要有灰球菌属(Bovista)、斜盖伞属(Clitopilus)、织球壳菌(Plectosphaerella)、刺盘孢属(Colletotrichum)、枝鼻菌属(Cladorrhinum)，其中灰球菌属相对丰度最高，占所有菌属的17.67%，为根中的优势菌属。根际土壤真菌群落属水平主要有镰孢菌属(Fusarium)、织球壳菌(Plectosphaerella)、赤霉菌属(Gibberella)、刺盘孢属(Colletotrichum)、枝孢菌属(Cladosporium)、斜盖伞属(Clitopilus)，其中镰孢菌属相对丰度最高，占所有菌属的21.09%，为根际土壤中的优势菌属。

表4 黔中金荞麦内生菌及根际土壤微生物属水平相对丰度(%)

3 讨论与结论

随着现代生物技术的不断发展，高通量测序技术因其具有免培养、信息量大等优点，已广泛应用于环境微生物、肠道微生物、植物内生菌等微生物多样性及群落分析研究中[12－14]。高通量测序技术不仅能获得植物内生菌菌群结构情况，用于分析组织内部生态水平与环境因子间的关系，还可筛选得到具有生物防治、发酵产物优良及能进行药材道地性鉴别的优质菌株。魏玉洁等[15]通过高通量测序技术分析新疆产区葡萄果实、叶片及土壤微生物多样性，得到包括5 个菌门、237 个真菌菌属和8 个菌门、314 个细菌菌属，为葡萄酒相关微生物多样性及葡萄种植产区提供理论支持。靳松等[16]利用Illumina MiSeq 高通量测序技术从石蝉草组织样本中分离得到167 个OTUs，归属于11 个门、26 个纲、48 个目、82 个科和104 个属，其中以变形菌门为优势菌群(62.48% ～93.24%)，同时发现内生细菌与石蝉草的抗炎抗肿瘤等活性有关。吴媛等[17]利用高通量测序技术结合高效液相色谱在朝鲜淫羊藿叶片中分离得到686 种内生真菌，归属于451 个属，其中横断孢属、念珠菌属、线黑粉酵母属等菌属与黄酮类化学成分呈正相关。宋昭昭等[18]从巨菌草分离得到1 株可用于生物防治的内生菌菌株JK7－2，并通过Illumina MiSeq 高通量测序分析得到该菌株有349 个与次级代谢产物合成相关基因，为相关次级代谢产物的生物合成机制研究提供参考依据。郭伟强等[19]采用宏基因测序技术分析得出野生及栽培人参内生细菌主要有变形菌门、硬壁菌门及放线菌门，其中类芽孢杆菌属、假单胞菌属、寡养单胞菌属在野生人参和栽培人参内生细菌中均为优势种群。

本研究表明黔中金荞麦茎叶的内生细菌群落丰富度及多样性低于根部，真菌的丰富度及多样性则比根部高。根际土壤各指数均高于黔中金荞麦茎叶和根部，微生物种类最为复杂、数量最多。可见植物内生真菌具有一定的器官组织特异性。从内生菌群落组成来看，黔中金荞麦内生细菌在门水平主要为蓝藻菌门(Cyanobacteria)、变形菌门(Proteobacteria)、放线菌门(Actinobacteriota)和厚壁菌门(Firmicutes)，真菌门水平上主要包括子囊菌门(Ascomycota)和担子菌门(Basidiomycota)，与其他植物内生菌研究结果[20]一致，说明植物内生菌在较大分类级别单元存在相似性；根际土壤细菌、真菌群落均较黔中金荞麦组织丰富，目前普遍认为植物内生菌主要来源于根际土壤，微生物由土壤进入根，随着蒸腾作用、营养运输到茎叶。

随着对药用植物内生菌研究的不断深入，挖掘与植物生长代谢相关的益生菌，筛选具有抗菌活性的菌株，可为解决药用植物资源紧缺、充分利用其药用资源提供新思路。黔中金荞麦内生细菌和真菌具有一定的多样性，下一步将对黔中金荞麦内生菌进行分离培养，对可培养菌株进行多样性分析，筛选具有生物活性的优势菌株，为进一步对黔中金荞麦内生菌的开发利用和资源保护提供理论依据。