马铃薯早疫病病原菌的分离鉴定及品种早疫病抗性评价

李秀华，梁瑞萍,张仙保，李文霞,王亮明

(包头市农牧业科学研究院，内蒙古包头 014013)

马铃薯早疫病(potato early blight)俗称夏疫病、轮纹病或干斑病，在我国和世界各马铃薯产区分布较为普遍，严重地块发病率大于80%，减产达30%以上[1-4]。该病主要为害叶片，也能侵害叶柄、茎和薯块。叶上病斑最初为褐色圆形斑点，以后逐渐扩大成圆至近圆形，褐色至暗褐色，病斑边缘明显，有清晰的同心轮纹，有时病斑外缘有较窄的黄色晕圈。据报道，马铃薯早疫病主要由茄链格孢菌(Alternariasolani)引起[5]，另有研究表明马铃薯早疫病的病原菌分别为Alternariasolani和Alternariaalternata[6]。包头地区是内蒙古自治区种薯和商品薯的主产区之一，早疫病是常发病害，危害较为严重。为确定当地早疫病病原菌的归属，笔者采用常规组织分离法对包头地区的马铃薯早疫病病原菌进行分离鉴定，并利用苗期喷雾接种对部分马铃薯品种早疫病抗性进行鉴定，以期为包头地区马铃薯早疫病的综合防控提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 病原菌的分离和纯化2019年6月陆续在包头市农牧业科学研究院院内和固阳县马铃薯试验区采集具典型同心轮纹的马铃薯早疫病病叶，依据常规组织分离法进行病原菌的分离、纯化，得到供试菌株，命名为“mls1”。将病原菌保存于PDA斜面上，置于4 ℃冰箱保存。

1.2 病原菌的形态学观察用直径5 mm的打孔器在菌落边缘打取一圈菌饼，挑针挑取菌饼接种于新的PDA平皿上，28 ℃恒温黑暗培养3～7 d。肉眼观察菌落颜色、形态、气生菌丝特点，OLYMPUS CX31显微镜下观察病原菌的形态结构。4～10 d后显微镜下观察分生孢子形态，测量分生孢子的大小，包括长、宽、横纵隔膜数、孢子颜色等。参考张天宇等[7-8]对链格孢属的特征描述进行鉴定。

1.3 病原菌的致病性测定病原菌置于PDA固体培养基上28 ℃恒温黑暗培养，7 d后用无菌水洗脱分生孢子，利用血球计数板制备成1×107个/mL孢子悬浮液。采用离体叶片法[9]，取新鲜无病虫害的马铃薯叶片，无菌水冲洗后置于75%乙醇中振荡消毒2 min，无菌水漂洗3次，置于铺有无菌湿滤纸的平皿内。采用涂抹法将孢子悬浮液接种于消毒后的马铃薯叶背面，空白对照以无菌水处理，置于25 ℃光照培养箱内培养，接种后每24 h观察1次。依据柯赫氏法则，发病后从病斑处再次分离病原菌，并与原接种菌进行比较。

1.4 病原菌rDNA-ITS 序列鉴定收集在PDA平板上培养8～10 d 的早疫病菌菌丝体，采用CTAB法提取病原菌基因组DNA[10]。利用真菌核糖体rDNA 转录间隔区(ITS) PCR 扩增的通用引物ITS1(5′-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3′)和ITS4(5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′)对提取的真菌总DNA进行PCR扩增。PCR 反应体系(25 μL)：2.0 μL dNTPs(10 mmol/L)，5.0 μL 10×Reaction buffer(with MgCl2)，0.5 μLTaq聚合酶(5 U/μL)，ITS1(10 μmol/L)和ITS4(10 μmol/L)各2.0 μL，2.0 μL模板DNA(30 ng/μL)，11.5 μL ddH2O。反应条件：94 ℃预变性2 min；94 ℃变性 45 s，50 ℃退火 45 s，72 ℃延伸 1 min，30 个循环；最后72 ℃延伸10 min，4 ℃保存。1%琼脂糖凝胶电泳检测，凝胶成像仪GelDoc-it2imager下观察照相，观察到预期条带后，PCR产物委托上海生工生物工程有限公司进行测序。

1.5 抗病性接种鉴定试验于2020年5月10日在包头市农牧业科学研究院育苗温室进行，供试品种购自内蒙古自治区固阳县精诚脱毒马铃薯繁育中心，种薯级别为原原种，经催芽后种植于花盆内，花盆内为育苗基质。每个品种播种25盆，每盆1粒，共计12个品种，3次重复。6月2日参试品种全部出苗。于4叶期喷雾接种鉴定菌株分生孢子悬浮液，分生孢子浓度为1×104个/mL，保湿(RH=100%)48 h后常规管理。温室温度为20～32 ℃。接种3 d后开始观察，第7天对供试品种逐叶按照9级标准调查发病率和病情指数。

马铃薯早疫病病害分级标准[11]，0级：叶片无病斑；1级：病斑面积占整个叶面积5%及以下；3级：病斑面积占整个叶面积6%～10%；5级：病斑面积占整个叶面积11%～20%；7级：病斑面积占整个叶面积21%～50%；9级：病斑面积占整个叶面积50%以上。抗病性评价标准[12]：免疫(I)，病情指数0；高抗(HR)，病情指数0～0.10；抗病(R)，病情指数0.11～20.00；中抗(MR)，病情指数20.01～40.00；中感(MS)，病情指数40.01～60.00；感病(S)，病情指数在60.01以上。

发病率(%)=发病叶片数/调查叶片数×100

2 结果与分析

2.1 病原菌形态特征将马铃薯早疫病病原菌“mls1”接种在PDA培养基上，于28 ℃恒温黑暗培养，如图1所示，其气生菌丝体生长快，较发达，初期气生菌丝灰白色，约4 d后转为灰绿色。PDA平皿上培养菌落形成以接种菌饼为中心的同心圆，约8 d长满直径9 cm的培养皿。如图2所示，显微镜下观察到气生菌丝有隔膜和分支，分生孢子梗颜色黄褐色，单生或呈分支状，较菌丝短且宽，宽5～10 μm。28 ℃恒温黑暗培养至4 d后，显微镜下可观察到分生孢子，由孢子梗顶端产生，单生或簇生，淡黄色至黄褐色，形态多样，为短棍形、梨形、长椭圆形等。1～4个横膈膜，0～3个纵、斜膈膜，大小多在(30～70) μm×(15～25) μm，多数顶端具喙，喙宽约5 μm。

注：a.培养7 d时菌落背面形态；b.培养7 d时菌落正面形态

图2 马铃薯早疫病“mls1”分生孢子形态

2.2 病原菌致病性将分离纯化后得到的马铃薯病原菌“mls1”菌株的分生孢子悬浮液接种于马铃薯健康离体叶片上，25 ℃恒温保湿光照培养，约4 d，接种“mls1”菌株的叶片出现典型的同心轮纹症状，空白对照无症状。对接种后表现典型早疫病症状的马铃薯病斑进行再分离、纯化，得到与原菌株一致的病原菌。依据柯赫氏法则，证实标记为“mls1”的原接种菌株为马铃薯早疫病的病原菌。

2.3 病原菌rDNA-ITS 序列鉴定利用CTAB法提取病原菌“mls1”基因组DNA，如图3所示，马铃薯早疫病菌基因组DNA大小约在5 000 bp，无降解，无污染。所提DNA经超微量分光光度计Thermo NanoDrop 2000定量到30 ng/μL，备用。利用真菌核糖体rDNA转录间隔区( ITS) PCR 扩增的通用引物 ITS1和ITS4对提取的真菌总DNA进行PCR扩增，在早疫病病原菌基因组DNA中扩增出1条540 bp左右的片段。PCR产物委托上海生工生物工程有限公司进行测序，结果表明，病原菌“mls1”的rDNA-ITS区大小为542 bp，将该序列与GenBank中已登录序列进行Blast比对。如图4所示，该菌ITS序列与链格孢属Alternaria同源性高，为100%，结合形态特性确定该病原菌为链格孢属真菌。

图3 马铃薯早疫病病原菌“mls1”基因组DNA(a)和ITS区PCR扩增产物(b)

图4 马铃薯早疫病病原菌ITS序列Blast比对结果

2.4 不同品种马铃薯早疫病抗性接种鉴定温室对12个马铃薯品种早疫病抗性接种鉴定，发现接种后3 d马铃薯叶片开始出现发病点，之后病斑开始扩展，约7 d形成轮纹状病斑，部分叶片干枯，之后发病进展缓慢。在供试的12个马铃薯品种中，仅“中薯3号”病情指数为23.44，依据抗病性评价标准可知，其对早疫病抗性评价是中抗。除“中薯3号”外，其余品种均是早疫病抗性品种，其中“荷兰15”发病率和病情指数最高(表1)。

表1 不同马铃薯品种抗病性接种鉴定

3 结论与讨论

马铃薯早疫病在内蒙古马铃薯主产区是常发病害，尤其夏季雨热同期发病较重，可侵染块茎，对马铃薯产量造成一定影响[13-15]。该研究利用rDNA-ITS 序列鉴定，将所分离马铃薯早疫病菌株鉴定到链格孢属(Alternaria)，未鉴定到种，这与已有报道类似[16-17]，下一步需设计特异性引物，再次进行鉴定。

同时，接种鉴定了包头地区一些市场栽培品种对早疫病的抗性，其中“中薯3号”属于中抗品种，其余属于抗性品种，在抗性品种中“荷兰15号”病情指数最高。赵艳群等[18]对部分马铃薯品种的早疫病田间抗性进行评价，其中“中薯3号”同为中抗品种，但病情指数高于该试验。Stewart等[19]以14个基因型马铃薯为试材，对其早疫病抗性进行了评价，认为温室接种鉴定和田间自然发病抗性鉴定结果一致。梁伟伶[20]对部分马铃薯品种进行了田间抗性鉴定和接种鉴定，评价结果略有不同。