痒螨病患兔下丘脑室旁核组织结构及其内5-HT的表达量变化研究

连俊琪，余兴邦，王 巍，田宗民，格根塔娜，李 颖，贾长生，王志刚，古小彬，周洪旭，邓桦林，唐 丽*

(1.内蒙古自治区呼伦贝尔市动物疫病预防控制中心，内蒙古呼伦贝尔 021000；2.四川农业大学动物医学院，四川成都 611130)

兔痒螨病主要由兔痒螨(Psoroptescuniculi)寄生于家兔的外耳道，导致患病动物发生剧烈的瘙痒、厌食、消瘦等临床症状，且伴有局部炎症并继发细菌感染，同时引发机体的免疫反应；病变严重时，可蔓延至脑部，引起患兔癫痫，直至死亡[1-2]。下丘脑室旁核(paraventricular nucleus，PVN)是下丘脑重要的核团之一，由靠近外侧的一群大细胞和靠近内侧的一群小细胞组成，参与机体体温、摄食、水平衡等重要的生理功能，并在神经免疫内分泌的调控中起整合中心的作用。PVN组织结构的变化必然伴随着相应生理功能的变化，进而引发一系列临床症状。研究表明，当发生疾病时PVN内神经元电位活动增强，其合成和分泌的催产素(oxytocin，OT)、加压素(vasopressin，AVP)、促肾上腺皮质激素释放激素(corticotropin releasing hormone，CRH)、神经肽Y(NPY)、5-羟色胺(5-HT)等物质不同程度参与了摄食调节、炎性疼痛的调控、机体的免疫反应及癫痫的发生与发展[3-7]。5-HT在哺乳动物的脑及神经突触内含量很高，是重要的神经递质和免疫调节因子。此外，PVN上也有5-HT受体，其可被5-HT激活，且5-HT纤维末端在PVN区域非常密集，PVN中5-HT受体也可上调CRH等信号系统，参与机体内分泌免疫调节[5，8]。

鉴于PVN及其内5-HT对镇痛、癫痫、摄食及免疫反应的调控作用，关于PVN及其内5-HT在兔痒螨病的发生与发展中的作用研究未见报道。笔者采用HE染色以及免疫组化(SABC)法，观察痒螨病患兔下丘脑PVN的组织结构及PVN内5-HT的表达量变化，以期探索下丘脑PVN的组织结构及其内5-HT在兔痒螨病的发生、发展中的作用，为兔痒螨病的防治提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 试验动物及其分组选取4—7月龄健康及患痒螨病的新西兰兔20只，体重2.5～3.5 kg，适应性饲喂7 d后宰杀。常规管理，自由采食和饮水。

参照痒螨病变评分系统[9]进行评分，选择耳部病变分别达到不同评分级别(1分、2分、3分组)的患痒螨病新西兰兔各5只，另选健康兔5只(0分组)。家兔静脉麻醉后，颈动脉放血处死；取脑组织固定于4%多聚甲醛-0.1%磷酸盐缓冲固定液，待用。

1.2 试验方法

1.2.1样本制作。取下丘脑(矢状切)用石蜡包埋，连续切片(厚度为4～6 μm)后分别进行常规HE法染色和SABC法染色(一抗5-HT由北京博奥森生物有限公司提供)，最后使用OLYMPS CH2OBIMF200光学显微镜观察。

1.2.2结果判定及数据统计分析。结果判定标准：阳性细胞的胞质出现棕黄色，根据显色程度分为3级，并结合Image Pro Plus图像分析系统中的平均积分光密度对结果进行判定：+++表示深棕色，强阳性；++表示中等着色，棕色，阳性；+表示着色浅，淡黄色，弱阳性。

光镜观察下丘脑PVN大、小细胞部的组织结构变化，描述病变特征。在10×40光镜下，使用Image Pro Plus 图像分析系统，每张切片按统一标准随机截取10个视野，测定其阳性产物的平均光密度(OD)和积分光密度(IOD)；利用SPSS 20.0统计软件进行数据统计分析，结果均以平均值±标准差表示；采用t检验分析差异显著性，P<0.05表示差异显著，P<0.01表示差异极显著。

2 结果与分析

2.1 组织病理学变化通过光镜观察发现，0分组下丘脑PVN核团清晰，细胞排列有序，神经元纤维突起明显；外侧大细胞部细胞结构完整，胞体较大，核质清晰；内侧小细胞部细胞结构完整，胞体较小，核质清晰；神经胶质细胞结构完整，数量较多，胞质着色较深(图1)。

与0分组相比，患病组(1分、2分、3分组)患兔下丘脑PVN大、小细胞的形态、数量及组织结构等均有不同程度的变化，且损伤程度随病变评分的增加而增加(双耳病变分数越高，患兔下丘脑PVN组织结构损伤越严重)。1分组：下丘脑PVN核团清晰，细胞排列有序，神经元纤维突起轻微减少，部分大细胞出现固缩；部分小细胞轮廓不清晰；神经胶质细胞结构正常，数量增加，胞质着色较深。2分组：下丘脑PVN核团不清晰，细胞排列混乱，部分大细胞轮廓不清晰，边缘模糊，部分细胞发生肿胀，胞体呈椭圆形；小细胞数量有减少趋势，部分胞质消失；神经胶质细胞着色变浅，部分细胞变形、呈多极状，胞体部分溶解，细胞数量有减少趋势。3分组：下丘脑PVN核团不清晰，细胞排列紊乱，大细胞部胞体呈不规则形状，轮廓模糊不清晰，部分细胞核仁崩解消失，胞质染色变浅；小细胞数量减少，分布稀疏，部分胞核不明显，胞质消失，周边组织有充血现象；神经胶质细胞胞浆内形成空泡，胞核崩解甚至消失，染色变浅，细胞数量明显减少(图1)。

注：A.健康组(0 分)；B.1分组；C.2分组；D.3分组；“→”表示室旁核小细胞部;“△”表示室旁核大细胞部;“▲”表示神经胶质细胞

2.2 痒螨病患兔下丘脑PVN内5-HT的表达量变化免疫组化结果(图2)显示，5-HT阳性产物为黄色或棕黄色，健康及患兔下丘脑PVN内均可检测到5-HT阳性产物分布于神经细胞的细胞质内。与0分组相比，各患病组下丘脑PVN大细胞部内5-HT的表达量极显著增加(P<0.01)，且1分组和2分组兔下丘脑PVN大、小细胞部内5-HT的表达量随双耳病变评分的增加而增加；与2分组相比，3分组下丘脑PVN大、小细胞部内5-HT的表达量减少(表1)。

2.2.1PVN大细胞部内5-HT的表达量变化。与0分组相比，患病组(1分、2分和3分组)下丘脑PVN大细胞部内5-HT的阳性信号增强(++)，平均积分光密度均极显著升高(P<0.01)，5-HT表达量增加；1分组和2分组的5-HT表达量均随双耳病变评分的增加而增加；与2分组相比，3分组5-HT表达量减少(P>0.05)。与1分组相比，2分组和3分组下丘脑PVN大细胞部内5-HT 的平均积分光密度均升高，5-HT表达量增加(表1，图2)。

2.2.2PVN小细胞部内5-HT的表达量变化。与0分组相比，患病组(1分、2分和3分组)下丘脑PVN小细胞部内5-HT阳性信号减弱，平均积分光密度均升高，5-HT表达量均增加；与0分组相比，2分组和3分组5-HT表达量极显著增加(P<0.01)；与2分组相比，3分组5-HT表达量极显著减少(P<0.01)。与1分组相比，2分组和3分组5-HT阳性信号增强(++)，平均积分光密度升高，5-HT表达量极显著增加(P<0.01)。与2分组相比，3分组下丘脑PVN小细胞部内5-HT的阳性信号强度差异不大，平均积分光密度极显著降低(P<0.01)，5-HT表达量减少(表1，图2)。

注：A.健康组(0 分)；B.1分组；C.2分组；D.3分组；棕黄色或褐色表示阳性信号;“▲”表示室旁核小细胞部，“△”表示室旁核大细胞部

3 讨论

3.1 痒螨病患兔下丘脑PVN组织结构的变化兔患痒螨病后出现厌食、消瘦、局部发炎及癫痫等临床症状[1-2]，而下丘脑PVN参与调节机体摄食活动、调控癫痫的发生和扩散、调节镇痛以及影响神经内分泌免疫活动[4-6]，而临床现象与组织结构的变化密切相关。该试验结果表明，痒螨病患兔出现上述临床症状，且与健康组相比，患病组患兔PVN大、小细胞组织结构受损程度随双耳病变评分的增加而增加。

研究显示，下丘脑PVN受到损伤后，分泌多种厌食神经肽，包括促甲状腺激素释放激素(TRH)、CRH和OT，且OT分泌量与抑制进食的效应呈正相关[10-11]。CRH与UCNS肽在中枢和外周均可引起厌食反应[12]。此外，唐亚杰[4]研究表明PVN通过释放激素、神经肽和神经递质等物质控制机体炎症的过度暴发，并对系统性炎症起到一定的控制作用。同时，PVN在应激及疼痛调节中发挥重要作用[13]。Eliava等[14]研究表明下丘脑PVN投射到脑干和脊髓的OT神经元诱发的OT释放可抑制炎性疼痛，并起到镇痛作用。张玉芹等[15]认为，脑细胞痫样放电时，可能是通过某种途径激活了下丘脑PVN小细胞内CRH的分泌，促进促肾上腺皮质激素(ACTH)和糖皮质激素的分泌，从而抑制了细胞的免疫功能。

该试验结果表明，PVN组织结构受损后，可能导致CRH、OT等激素分泌增加，引起厌食行为的发生；当双耳病变程度较轻时，PVN部分细胞发生病变，可能引起OT表达量的增加，对虫咬引起的疼痛以及局部发炎引发的炎性疼痛可起到一定的镇痛或调节作用，但在双耳病变程度加重时PVN组织结构受损严重，使得PVN的神经内分泌功能失调，可能导致OT分泌量减少，使得中枢神经对镇痛的调节作用减弱；此外，当双耳病变程度较轻时，兔下丘脑PVN小细胞内CRH分泌量增加，抑制了细胞免疫功能和癫痫痉挛等神经症状；随着病变程度的加剧，兔下丘脑PVN组织结构受损严重，导致细胞功能异常，可能导致CRH分泌量减少，对癫痫痉挛的抑制作用减弱，故患兔出现癫痫等神经症状；PVN结构受损导致的细胞免疫功能下降及癫痫的发作可能是导致兔死亡的主要原因，但其具体作用机制还有待进一步的研究。

综上所述，痒螨病患兔下丘脑PVN大、小细胞部损伤程度随双耳病变评分的增加而增加。由此可见，兔痒螨不仅可直接引发兔耳部的病理损伤，而且可引起中枢神经系统的病理损伤，但具体调节机制有待进一步的研究。

3.2 痒螨病患兔下丘脑PVN内5-HT表达量的变化5-HT是下丘脑PVN内最主要的神经递质，参与跟疾病有关的摄食、癫痫、痛觉、镇静等临床反应以及炎症引发的免疫反应[5-7]。

研究表明，5-HT作为一种重要的瘙痒介质，广泛存在于脑中，其可通过5-HT1A、5-HT2A、5-HT3、5-HT7等受体参与痒觉调控[16]。5-HT受体广泛分布于PVN中[8]，PVN中5-HT1A和5-HT1B受体的激活构成了重要的饱腹感信号[5]，可通过刺激PVN中CB1受体抑制5-HT的释放，发挥一定的抑制摄食作用。Hasler等[17]研究发现5-HT1A受体与癫痫的发生存在着密切的联系，且可降低脑内5-HT水平，加剧癫痫的发作。

该试验结果表明，与健康组(0分组)相比，痒螨病患兔PVN大、小细胞部内5-HT的表达量均增加，且患兔出现上述厌食、消瘦、瘙痒、癫痫等临床表现。虽然与2分组相比，3分组PVN内5-HT表达量减少，但其PVN大、小细胞内5-HT的表达量均高于健康组，推测其原因在于当感染程度较轻时PVN组织结构的损伤亦较轻，机体尚具备自我修复的功能，且通过提高5-HT的表达量来促进机体的自我修复，但病变程度加重时PVN组织结构受损亦严重，直接导致5-HT的表达量下降。

下丘脑PVN内5-HT表达量的增加对癫痫有抑制作用；下丘脑PVN内5-HT表达量的减少对摄食具有促进作用。林毅等[18]研究表明色氨酸是5-HT在体内生物合成的前体物质，膳食中添加色氨酸可增加血液和下丘脑内5-HT的表达量。因此，在痒螨病患兔病变较轻时，建议使用5-HT拮抗剂或减少饲料中5-HT合成前体物质色氨酸的添加量，以辅助治疗出现的厌食和消瘦等临床症状；当病变较重时，在饲料中适量添加色氨酸，以缓解兔在感染后期出现的癫痫等神经症状，但此建议是否可行还需要进一步验证。

综上所述，痒螨病可导致兔下丘脑PVN的组织结构受损、5-HT表达量增加，提示下丘脑亦是痒螨病的靶器官之一；同时，5-HT可能参与了痒螨病的发生与发展。