基于RAPD分子标记的黑麦草遗传多样性分析

苗贵东，吴小梅，杨慧连，牛秋芳

(1.兴义民族师范学院民族药用生物资源研究与开发重点实验室,贵州兴义 562400;2.贵州省化学合成及环境污染控制和修复技术特色重点实验室,贵州兴义 562400;3.兴义民族师范学院生物与化学学院，贵州兴义 562400)

黑麦草(LoliumperenneL.)(2n=2x=14)是被子植物门单子叶植物纲禾本科黑麦草属(Lolium)植物[1]。黑麦草种子狭长，4～6 mm,成熟后易脱落，千粒重1.5 g[2]。黑麦草的营养价值较高，营养成分富含蛋白质、矿物质和维生素，其中粗蛋白含量较为丰富，品质优良，适口性好，因此为多种家畜所喜食，消化率70%左右[3]。由于其优良的饲草性，因此筛选优质牧草品种对于山地资源利用和精准扶贫有极大的推动作用，具有重要的实际应用价值。

RAPD (random amplified polymorphic DNA)，即随机扩增多态性DNA标记,RAPD是建立在PCR (polymerase chain reaction)基础之上的一种可对整个未知序列基因组进行多态性分析的分子技术,是由美国的Williams等[4]和加利福尼亚研究所Welsh等[5]领导的2个研究小组于1990年同时提出的。目前该技术已大量应用于系谱分析及进化关系等方面的研究。目前该标记技术还应用于多年生黑麦草的遗传多样性和品种资源研究[6-7]。RAPD分子以一些人工合成的不同随机寡核苷酸序列(10 bp) 作为引物，对所研究的基因组DNA(模板DNA)在Taq聚合酶的催化下，以dNTP作为原料进行PCR酶促体外扩增反应，从而产生不连续的DNA产物，扩增的产物可以通过聚丙烯酞胺凝胶或者琼脂凝胶电泳分离和溴化乙锭(EB)染色，在紫外灯下可检测扩增DNA片段的多态性。RAPD标记的特点为标记数量多，可以覆盖基因组中所有位点；引物通用，成本低；操作简单；使用的模板DNA量极少；操作安全，试剂毒性小等[8]。笔者运用RAPD标记技术对黔西南引种的黑麦草群体开展群体遗传多样性分析，通过筛选RAPD标记引物、PCR体系优化及群体扩增，评价引种群体遗传多样性，旨在为开展群体选择及种质资源评价研究奠定基础。

1 材料与方法

1.1 试验地概况试验用地块设在贵州省兴义市顶效镇兴义民族师范学院试验基地，坐落于贵州省西南部，地处105°36′E，25°12′N，海拔1 270～1 480 m,具有亚热带季风气候特征，干旱，日照长，无霜期300 d左右，年均气温14～19 ℃。雨热同季，降水量在1 300～1 600 mm。试验地属于沙质土，土壤贫瘠。

1.2 试验材料所选取的黑麦草品种来源于江苏省，选取均匀一致、品质良好的黑麦草种子。在试验基地进行黑麦草种植，到可收割期后，按照随机选取方法随机选取24株样本，组成试验群体。

1.3 黑麦草种植选用优质黑麦草种子，综合参照文献的方法[9-13]，确定种植时间及播种方法[14]。2018年12月26日黑麦草高度35～68 cm时收割，采用随机采样法采集24个样本植株，分别放入24个采样袋中并依次标记1～24个序号，采集完毕后将样本材料放到-80 ℃冰箱中冷冻保存备用，黑麦草收割后的留茬高度约为5 cm，并追肥尿素，浇水灌溉，待其生长高度达到可收割的高度时即可进行再次收割。

1.4 试验方法对通过PCR扩增的群体试验结果采用群体遗传的分析方法进行遗传多样性分析及群体聚类分析。

2 结果与分析

2.1 黑麦草基因组DNA的提取及检测经过查阅相关文献[15-18]，提取黑麦草24个嫩叶中的基因组DNA，用琼脂糖凝胶电泳检测得到基因组DNA(图1)。

注：M.DL 2000 Marker；泳道1～10. 黑麦草个体DNA

2.2 RAPD引物筛选经过多次PCR条件优化与引物PCR扩增筛选，35条RAPD引物中，最终有6个引物获得较好扩增(C13、C02、D16、E03、A18、B05)。将这些引物用于后续群体扩增，在由24个个体组成的黑麦草群体中，6个引物扩增获得的清晰可统计的RAPD扩增条带共52条，部分引物扩增产物通过琼脂糖电泳后在凝胶成像系统成像的结果见图2。

注：M.DL 2000 Marker

2.3 RAPD-PCR反应体系优化试验材料为黑麦草DNA，选取51条RAPD引物进行筛选，依据文献[19-22]，体系中10×buffer含量为2.5 μL，DNA模板为2.0 μL固定不变，对6个因子(dNTP、MgCl2、Taq酶、引物浓度、退火温度和反应循环数)均设置不同浓度梯度(表1)。

表1 RAPD-PCR反应体系优化的各成分及浓度梯度

2.3.1最佳Mg2+浓度的确定。Mg2+浓度直接影响酶活性，从图3可见，Mg2+浓度大于2.6 mmol/L或低于2.6 mmol/L时，条带弥散。因此，选择2.6 mmol/L Mg2+为最佳反应水平。

注：M.DL 2000 Marker；泳道1～6. Mg2+浓度2.5、2.6、2.7、2.8、2.9、3.0 mmol/L

2.3.2最佳dNTP浓度的确定。dNTP是PCR反应的原料之一，其量不能过多也不能过少，过少会使反应不充分，而过多则会抑制Mg2+，最终影响聚合酶的活力。从图4可见，0.55 mmol/L为最佳dNTP浓度。

注：M.DL 2000 Marker；泳道1～10. 0.10、0.15、0.20、0.25、0.30、0.35、0.40、0.45、0.50、0.55 mmol/L dNTP

2.3.3最佳Taq酶浓度的确定。Taq酶的活性以及用量对扩增的结果影响很大，用量过少，则扩增出的条带少或无扩增；用量过多，则扩增出的条带弥散或者非特异性条带增多。从图5可见，Taq酶的用量以0.20 U效果最好。

注：M.DL 2000 Marker；泳道1～8. 0.10、0.15、0.20、0.25、0.30、0.35、0.40、0.45 U Taq酶

2.3.4最佳引物浓度的确定。从图6可见，经过多次分析和比较，引物浓度在0.40 mmol/L时条带清晰且非特异性条带极少。因此，最佳引物浓度为0.40 mmol/L。

注：M.DL 2000 Marker；泳道1～9. 0.10、0.15、0.20、0.25、0.30、0.35、0.40、0.45、0.50 mmol/L

2.3.5最佳退火温度的确定。退火温度过低或者过高均会引起非特异性扩增的增多。从图7可见，最终确定35 ℃为最佳退火温度。

注：M:DL 2000 Marker；泳道1～8. 32、33、34、35、36、37、38、39 ℃

2.3.6最佳循环次数的确定。从图8可以看出，40次循环次数产生的带型最好，因此40次循环为最佳循环。

注：M.DL 2000 Marker；泳道1～7. 25、30、35、40、45、50、55个循环

2.3.7最优反应体系的确立。优化后的PCR总反应体系10×Buffer 2.50 μL，MgCl22.60 μL，dNTP 1.375 μL，DNA模板 2.00 μL，Primer 0.750 μL，Taq酶 0.750 μL，ddH2O 15.025 μL，总计25 μL。RAPD-PCR反应程序见表2。

表2 PCR反应程序

2.4 多样性分析黑麦草RAPD引物在群体中扩增后经过琼脂糖电泳后在凝胶成像系统得到的部分结果见图9。多态位点比率是指具有多态性的位点数占检测到的位点数的比例，它是可以衡量一个种群内遗传变异水平高低的重要指标，可用于分析黑麦草种内之间遗传变异率，针对多态性的分析结果见表3。由表3可知，6个引物共扩增出52条，其中具有多态性的条带有49条，无多态性的条带有3条，多态性条带比率(PPB)为94.23%，这表明供试黑麦草群体的多态性高。

表3 引物序列与扩增结果

注：M.DL 2000 Marker

2.5 遗传多样性分析将筛选出的6个引物扩增条带按照从小片段到大片段依次进行统计，有条带的记1，没有条带的记0。统计好的数据通过NTsys软件进行相似系数的计算和聚类分析，结果见图10。试验结果分析表明，引种黑麦草个体间遗传差异较大，引种品种种群遗传差异具备一定遗传可选性。由聚类分析结果可以看出，24个个体聚为5个分支，遗传差异较大，因此群体具有较高的遗传多样性，种群多样性可为开展物种群组选育研究奠定基础。

图10 黑麦草24个个体的聚类分析树状图

3 结论

通过PCR条件优化，其中RAPD引物最终获得的最优反应条件为：Mg2+浓度2.6 mmol/L,dNTP浓度为0.55 mmol/L，引物浓度为0.4 mmol/L,Taq酶浓度为0.20 U，最佳退火温度35 ℃，最佳循环数为40个，最适模板含量约为100 ng DNA。

对24个黑麦草个体进行了遗传多样性分析，共筛选出6个效果较好的引物可用于PCR扩增，总共获得RAPD标记谱带52条，其中有多态性条带49条，多态性条带百分率为94.23%，其多态性较高。引种黑麦草的遗传差异较大，对贵州省黔西南州地区的环境适应性较高，具备一定的可选育性。种群多样性为开展品种群组选育和遗传选育研究奠定重要的遗传学基础，也为培育符合地方需求的品系奠定基础。