酸甘化阴法对NOD小鼠唾液腺中AQP5、M3R及外周血干燥综合征特异性抗体的影响

杨志霞，黄 裕，王 丹

(上海中医药大学附属岳阳中西医结合医院，上海 200437)

干燥综合征是一种以侵犯唾液腺、泪腺等外分泌腺为主的慢性自身免疫性疾病，外周血中毒蕈碱受体3(muscarinic receptor，M3R)抗体及SSA、SSB、抗α-胞衬蛋白(α-fodrin)抗体均是诊断该病的特异性抗体[1]。患者临床主要表现为口干、眼干，累及内脏时可导致间质性肺炎、远端肾小管酸中毒、肝功能异常等。目前干燥综合征的病因及发病机制尚不明确，但研究发现口干症状的出现与患者唾液腺水分子通道蛋白-5(aquaporin protein-5, AQP5)的异常表达有关[2]。中医典籍中并无干燥综合征病名的记载，1989年路志正教授提出“燥痹”作为干燥综合征的中医对应病名[3-4]。该病西医主要采用糖皮质激素、免疫抑制剂等全身免疫调节药物治疗，但只限定于活动期的系统受累的干燥综合征患者。与西药治疗相比，中药治疗更能有效缓解干燥综合征患者的口眼干燥及临床总体症状，控制病情进展，增加唾液和泪液流率[5]，尤其是轻型干燥综合征患者，可采用单纯中药治疗。酸甘化阴法是目前中医常用的治疗方法，张仲景《伤寒论》中的芍药甘草汤是酸甘化阴法的代表方剂。相关研究证实芍药甘草汤能上调干燥综合征模型大鼠颌下腺中 AQP5 的表达[6]，但具体机制不明。本实验通过观察不同比例药物配比的芍药甘草汤对NOD小鼠唾液腺中AQP5、M3R及外周血干燥综合征特异性抗体的影响，探讨酸甘化阴法治疗干燥综合征的可能起效机制，并为处方进一步优化提供依据。

1 实验材料与方法

1.1实验动物 近交系SPF级NOD雌性小鼠75只，8周龄，体重18～22 g，购自上海斯莱克实验动物有限责任公司[动物合格证号： SCXK(沪)2012-0002]。小鼠在上海中医药大学动物实验中心SPF级动物房中隔离饲养，温度18～ 22 ℃，湿度50%～60%，光照周期12/12 h。该实验通过了上海斯莱克实验动物有限责任公司实验动物管理委员会的批准。

1.2实验药物 芍药甘草汤：白芍12 g、生甘草6 g(2∶1)为低剂量，白芍18 g、生甘草6 g(3∶1)为中剂量，白芍30 g、生甘草6 g(5∶1)为高剂量，根据人的用量换算成小鼠用量：小鼠给药量(g/kg)=人用剂量×0.002 6×50(g/kg)， 由上海中医药大学附属岳阳中西医结合医院制剂室制备，合生药浓度1 g/mL。 毛果芸香碱注射液：山东博士伦福瑞达制药有限公司，规格：0.1 g/支，由上海中医药大学附属岳阳中西医结合医院西药房提供。

1.3试剂及仪器 苏木精-伊红(HE)试剂盒购珠海贝索生物技术有限公司(批号：2018001)；辣根过氧化物酶(HRP)标记的山羊抗兔二抗和PNP显色试剂盒购自碧云天生物技术有限公司(批号：2018002)；小鼠抗SSA、SSB、M3R、α-Fodrin ELISA试剂盒购自江苏酶免实业有限公司(批号：2018006)；反转录试剂盒购自碧云天生物技术有限公司(批号：2018006)；SYBRPremix Ex TaqⅡ试剂盒购自上海酷乐生物科技有限公司(批号：2018008)。紫外可见分光光度计(ELX800，Bio-Teck)；正置显微镜(BX51，Olympus)。

1.4实验方法 小鼠适应性饲养1周后，随机分为5组各15只。芍药甘草汤低、中、高剂量组分别给予相应浓度芍药甘草汤19.5 g/kg灌胃，同时给予生理盐水腹腔注射，1次/d；毛果芸香碱组给予毛果芸香碱注射液1.4 mg/kg腹腔注射，1次/d；生理盐水组给予生理盐水灌胃，1 次/d。各组均连续干预6周。

1.5标本采集 干预结束后，采用腹腔注射0.3%戊巴比妥钠30 mg/kg麻醉小鼠，眼球采血，置于普通抗凝管中，离心收集血清，并在-80 ℃下保存。处死各组小鼠，取颌下腺，一侧颌下腺采用10%福尔马林固定制备石蜡切片，一侧颌下腺-80 ℃冻存。

1.6检测指标及方法

1.6.1颌下腺的病理形态 取各组小鼠颌下腺石蜡切片，常规脱蜡脱水后，将切片置于苏木素中染色10 min，后用流动水冲洗10 min左右，待组织块变蓝后置于伊红中染色3 min。取出切片，进行梯度乙醇脱水(95%无水乙醇1 min，95%无水乙醇1 min ，无水乙醇1 min，无水乙醇45 s)，二甲苯清除。树胶封片，置通风橱中晾干，显微镜下观察组织病理形态。

1.6.2颌下腺中AQP5及M3R mRNA表达情况 采用real-time PCR法检测：取冻存的各组小鼠颌下腺，按照Trizol说明书分离颌下腺组织或腺泡细胞总RNA，用紫外分光光度计测定其浓度和纯度，采用反转录试剂盒将RNA反转录成cDNA。引物采用primer Premier 5.0软件设计，AQP5的上游引物为5’-CTCGCAACGCAGTATCTCA AGT-3’，下游引物为5’-GCCATCTATCCCTCTCCTGAAG-3’，M3R 的上游引物为5’-GTTACCCTCATCGGACAACCT-3’，下游引物为5’-TTACCCACTGAGGAGTTGACG-3’，采用磷酸甘油醛脱氢酶(GAPDH) 作为内部参照。使用SYBR Premix Ex Taq Ⅱ试剂盒进行荧光定量PCR。PCR的反应条件：94℃预变性1 min，94 ℃变性30 s，55 ℃退火45s，72 ℃延伸1 min，30个循环，用2-△△Ct法计算AQP5 及M3R mRNA的相对表达量。

1.6.3血清中特异性抗体含量 取各组小鼠血清，按试剂盒提供的操作流程，用酶联免疫吸附法测定血清中抗SSA、SSB、M3R、α-Fodrin抗体含量。

2 结 果

2.1各组小鼠颌下腺HE染色病理形态 生理盐水组和毛果芸香碱组NOD小鼠颌下腺淋巴细胞浸润明显，可见灶性淋巴细胞浸润；芍药甘草汤各剂量组小鼠淋巴细胞浸润灶明显减少，其中芍药甘草汤高剂量组仅可见少许淋巴细胞浸润。见图1。

图1 各组 NOD小鼠颌下腺HE染色病理形态(×200)

2.2各组小鼠颌下腺中AQP5及M3R mRNA相对表达量比较 芍药甘草汤各组AQP5及M3R mRNA相对表达量均明显高于生理盐水组(P均<0.05)，毛果芸香碱组与生理盐水组比较差异均无统计学意义(P均>0.05)；芍药甘草汤中剂量组AQP5及M3R mRNA相对表达量均明显高于芍药甘草汤低剂量组(P均<0.05)，且AQP5 mRNA相对表达量明显高于芍药甘草汤高剂量组(P均<0.05)。见表1。

表1 各组NOD小鼠颌下腺中AQP5及M3R mRNA相对表达量比较

2.3各组小鼠外周血中抗SSA、SSB、M3R、α-Fodrin抗体含量比较 与生理盐水组比较，毛果芸香碱组和芍药甘草汤各组血清中抗SSA、SSB、α-Fodrin抗体含量均明显降低(P均<0.05)，血清中抗M3R抗体含量均明显升高(P均<0.05)；芍药甘草汤中、高剂量组血清中抗SSA、SSB、α-Fodrin抗体含量均明显低于毛果芸香碱组和芍药甘草汤低剂量组(P均<0.05)，且芍药甘草汤高剂量组均明显低于芍药甘草汤中剂量组(P均<0.05)；芍药甘草汤中、高剂量组血清中抗M3R抗体含量均明显高于毛果芸香碱组和芍药甘草汤低剂量组(P均<0.05)，且芍药甘草汤高剂量组明显高于芍药甘草汤中剂量组(P<0.05)；芍药甘草汤低剂量组血清中抗SSA、α-Fodrin抗体含量与毛果芸香碱组比较差异均无统计学意义(P均>0.05)，血清中抗SSB抗体含量低于毛果芸香碱组(P<0.05)，血清中抗M3R抗体含量明显高于毛果芸香碱组(P<0.05)。见图2。

图2 各组 NOD小鼠外周血中抗SSA、SSB、M3R、α-Fodrin抗体含量

3 讨 论

干燥综合征起病于燥，故大多数医家根据“诸涩枯涸，皆属于燥”的观点，将其归于“燥证”范畴。燥证病因多端，病机复杂，《杂病源流犀烛》中云 “燥之为病，皆阳实阴虚，血液衰耗所致也”，提示该病根本在于阴血亏耗，津液不足，而失去了它的滋润濡养之功，呈现一派干燥焦枯之象，与现代医学描述的干燥综合征患者眼干、口干之症相符合。

酸甘化阴法为张仲景首创，是指将酸味药与甘味药配伍，按异类相使的配伍原则，达到滋阴养血生津作用的一种治法，代表方剂为芍药甘草汤，用于治疗干燥综合征可使其久亏之阴得以自复，阴液渐充而燥象渐消，诸症可缓。从五味归经角度分析，酸甘两味药具有“酸先入肝，甘先入脾”的特征，酸味药入肝而能补肝体以制肝用，甘味药入脾而能补益脾胃，有甘缓养胃、调肝缓急之功，两者合用，产生“酸得甘助而生阴”的效果；从五脏开窍角度来讲，肝开窍于目，在液为泪，泪从目出；脾开窍于口，在液为涎，且脾主运化，具有运化水谷精微及水液的作用，与唾液的分泌密切相关。酸甘化阴法将药物归经理论和脏腑理论完美结合，以养脾胃津液和补肝阴。课题组前期研究证实以酸甘化阴法组方治疗干燥综合征，可有效缓解患者口干、眼干、便秘等主要临床症状，降低免疫球蛋白(IgA、IgM、IgG)水平，调节自身免疫[7]。本实验进一步探讨了其作用机制。

AQP5是最早被确定分布在唾液腺泡细胞腺泡腔的顶膜、侧膜及导管上皮细胞中，能特异性跨膜转运水的蛋白[8-9]，唾液腺中蛋白激酶C( PKC)、cAMP、蛋白激酶A(PKA)几种刺激分泌的关键因子均通过作用于 AQP5 从而影响唾液腺的分泌[10-11]。相关实验研究发现，敲除 AQP5 基因的大鼠经毛果芸香碱刺激后，其唾液分泌量减少了 60% 以上，证实唾液流率与 AQP5 在涎腺中的表达量显著相关[12-13]。AQP5在胞内PKA介导的磷酸化作用下，可产生快速“闸门”效应，使水分子经过质膜向高渗方向快速移动，但其水转运能力受其表达数量和表达位置(功能性水通道数目)的影响[14]，如果腺体上皮细胞中缺乏AQP5，则其水转运能力会发生异常，使得唾液流率下降，产生口干的症状[15-16]。肖林等[17]发现在干燥综合征患者唇腺中，AQP5在腺泡顶膜表达减少，而基侧膜表达增强，这种表达部位的“易向”可能是AQP5将水分从腺泡细胞顶膜向基侧膜逆向转运，使唾液分泌减少，产生口干症状的原因。

M3R是一种单链跨膜糖蛋白，主要分布于外分泌腺，影响着唾液腺的液体分泌[18]。干燥综合征患者外周血中存在M3R抗体，其与患者的唾液腺分泌功能障碍密切相关[19]。AQP5是 M3R 调节唾液分泌的效应蛋白之一，抗M3R抗体可定向攻击M3R受体，导致M3R与毒蕈碱结合减少，不能进一步激活胞内转导信号，使得AQP5磷酸化受限，影响其水转运能力，从而抑制原发性干燥综合征患者腺体分泌，产生口干、眼干症状[20-21]。

本实验结果显示，与生理盐水组比较，芍药甘草汤各剂量组小鼠淋巴细胞浸润灶较少，唾液腺中AQP5及M3R mRNA相对表达量和血清中抗M3R抗体含量明显升高，血清中抗SSA、SSB、α-Fodrin抗体含量明显降低；芍药甘草汤中剂量组AQP5及M3RmRNA相对表达量均明显高于芍药甘草汤低剂量组，且AQP5 mRNA相对表达量明显高于芍药甘草汤高剂量组；芍药甘草汤高剂量组血清中抗SSA、SSB、α-Fodrin抗体含量均明显低于芍药甘草汤低、中剂量组，血清中抗M3R抗体含量均明显高于芍药甘草汤低、中剂量组。提示酸甘化阴法组方芍药甘草汤可通过上调NOD小鼠唾液腺中AQP5及M3R的表达，降低血清中抗SSA、SSB、α-Fodrin抗体含量，改善腺体分泌能力，缓解口干症状，且芍药甘草汤中、高剂量对干燥综合征靶器官中的目标蛋白影响更为显著，这为后续进一步优化处方提供了依据。但芍药甘草汤是复方制剂，其改善腺体分泌能力的起效机制复杂，也可能与阻断M3R所介导的一系列免疫反应有关，也可能从其他机制调节，还需进一步研究。

利益冲突：所有作者均声明不存在利益冲突。