毛果芸香碱对不同光照下斑马鱼幼鱼自发运动和焦虑性行为的影响

简 静 林 佳 刘秀云 张颖蓝 李 斐 王 凤 李婷婷 郭 宁 李 强

(1复旦大学附属儿科医院儿科研究所-复旦大学儿童发育与疾病转化医学研究中心-上海市出生缺陷防治重点实验室 上海 201102; 2上海中医药大学中医方证与系统生物学研究中心 上海 201203)

斑马鱼是科学研究广泛使用的一种重要脊椎动物模型[1],目前已被广泛用于遗传、毒理[2-3]和发育生物[4]等学科的研究。Rihel等[5]证明斑马鱼可以作为神经系统相关药物研究的一个快速、可靠且成本较低的工具, 在神经疾病的病因学方面与啮齿动物和人类有许多共同性[6]。4～5天的斑马鱼幼鱼即可表现出狩猎,回避和趋触等广泛的行为学[7-9]变化,在人类认识疾病的发病机制和新药的研发过程中发挥着重要的作用[10-11]。斑马鱼的冻结、旋转[12]、漫淡、聚集[13]、沉底、回避和趋触[14]等行为都可以反映斑马鱼幼鱼的神经性行为,且趋触性已经被作为衡量斑马鱼幼鱼压力/焦虑水平的最重要指标,可直接在多孔板中进行。

趋触性行为是指动物在所处区域边界附近停留或移动的偏好。将多孔板中心占整个孔面积50%的圆形区域定义为斑马鱼的中心活动区域。用两个相互关联的参数来研究斑马鱼幼鱼的趋触性行为：第一个为斑马鱼幼鱼在中心区域移动距离的百分比(后文公式1),第二个为斑马鱼幼鱼在中心区域花费时间的百分比(后文公式2)。

毛果芸香碱是常用的胆碱能激动剂,研究人员常通过毛果芸香碱诱导大鼠的慢性癫痫持续状态对慢性癫痫生理学和治疗手段进行探索[15]。 有研究者用毛果芸香碱诱导的小鼠癫痫模型具有显著的焦虑样状态[16-17],但对用抗癫痫药物进行干预时却只发现其抑郁状态显著降低而焦虑未被抑制[17-18],Liu和 Duarte等[19-20]的研究结果表明毛果芸香碱对大鼠具有致焦虑的特性。以上结果表明毛果芸香碱具有诱发啮齿类动物产生焦虑的作用,但很少有研究者在斑马鱼上进行毛果芸香碱的研究。探索毛果芸香碱对斑马鱼幼鱼自发运动和焦虑相关因素的影响可以为斑马鱼焦虑模型的建造和焦虑症状的治疗提供新思路新方向。

光照-黑暗交替的视觉反应测试可以引起斑马鱼幼鱼的超运动行为,在光照-黑暗转变期间斑马鱼幼鱼趋触性行为增加[21]。 因此,我们研究了毛果芸香碱在连续光照和光照-黑暗交替条件下对5天龄(5dpf)和7天龄(7dpf) AB型斑马鱼幼鱼自发运动和趋触性行为的影响,并发现毛果芸香碱诱导AB型斑马鱼幼鱼产生的焦虑反应呈现出药物浓度和斑马鱼幼鱼年龄的依赖性。

材料和方法

实验动物野生AB型斑马鱼,复旦大学附属儿科医院儿研所斑马鱼平台。 根据Westerfield《斑马鱼胚胎发育指南》[22],将斑马鱼饲养在(28.5±0.5) ℃的条件下。斑马鱼自然交配后收集胚胎至直径90 mm的培养皿中,每培养皿养殖50颗左右鱼卵。从出生到7dpf的鱼卵培养皿均放置在(28.5±0.5) ℃的培养箱中培养,期间不予喂食。每天给予14 h光照和10 h黑暗周期(08∶00时开灯,22∶00关灯)。所有动物实验测试程序均符合国际规定,所有协议由复旦大学附属儿科医院动物管理委员会授权。

药物将毛果芸香碱(P6503-5G,Sigma-Aldrich)用无菌水溶解到10 mmol/L储备溶液中,并以1 mL每管冷冻于-20 ℃冰箱。实验之前,将毛果芸香碱储备液用斑马鱼系统水稀释到所需浓度。

仪器和耗材斑马鱼养殖系统-北京爱生公司,Leica205C显微镜-德国Leica公司,ZebraLab分析系统-法国Viewpoint公司;细胞培养24孔TCT板-上海吉泰远成公司。

旷场实验所有行为测试都在环境温度为28.5 ℃的房间内进行,斑马鱼幼鱼鱼卵随机分配在24孔板中进行行为学测试。所有实验均在培养箱中光照后2 h和黑暗前2 h之间进行。每个24孔板中鱼卵均匀的呈现所有浓度,以避免实验次序导致的任何差异。

行为学检测开放旷场和光照设计如图1所示:在实验前将斑马鱼幼鱼转移至24孔板中,每孔中一条幼鱼,孔的内径为15.88 mm,幼鱼可自由活动(图1A)。去除孔中多余的液体后立即加入1 mL的毛果芸香碱工作溶液,毛果芸香碱最终的测试浓度为0、0.1、0.3、1、3、10 mmol/L。然后将24孔板放入带有记录仪(ViewPoint Life Sciences)的ZebraBox中记录斑马鱼幼鱼的活动视频。实验设置为20 min光照适应,10 min持续光照研究斑马鱼幼鱼的自发运动和趋触性,然后分别是5 min黑暗刺激和5min光照恢复(图1B),以检测在光照变化时毛果芸香碱对斑马鱼幼鱼自发运动和趋触性的影响。因此,包括适应期在内,每次实验持续40 min。图2显示的是不同浓度的毛果芸香碱在整个实验过程中对斑马鱼幼鱼每分钟自发游动距离的影响。

A:The testing apparatuses consist of each well in a 24-well plate format (diameter of 15.88 mm).The inner and outer zones were delineated as shown above.The width of the outer zone was set at 2.34 mm relative to the border of the well;B:The procedure including acclimatization and experiment procedure,acclimatization 20 mins,and experiment procedure light phase (0-10 min),sudden illumination transition from light to dark phase (10-15 min) and dark to light phase (15-20 min).
图1 开放旷场和光照设计示意图
Fig 1 The open field test and light testing apparatuses

参数计算使用ZebraLab软件的跟踪模式来记录视频,完成斑马鱼幼鱼运动行为的定量。斑马鱼幼鱼的视频以25 fps的速率拍摄,可检测幼鱼任意速度级别的运动。在每个孔中,确定了一个占据单井面积一半的圆形中心区域。幼鱼在整个孔中移动的距离可以用来分析斑马鱼的自发运动。对趋向性行为的分析来自于[23]对移动距离和幼鱼在中心舞台上花费的时间的修改。 公式如下所示

(公式1)

(公式2)

结 果

连续光照条件下毛果芸香碱对不同年龄阶段斑马鱼自发运动的影响毛果芸香碱对5dpf斑马鱼自发运动的影响以药物浓度0.3 mmol/L分为两个阶段。0.1 mmol/L的毛果芸香碱对斑马鱼幼鱼的自发运动有明显的抑制作用(P=0.021 3);而当药物浓度大于0.3 mmol/L后,随着药物浓度的增加反倒对斑马鱼的自发运动有一定的刺激作用但均没有统计学意义(图3A)。

毛果芸香碱对7dpf斑马鱼自发运动的影响不同于对5dpf斑马鱼,只有10 mmol/L毛果芸香碱使斑马鱼幼鱼的游动距离减弱,其他各组均表现出一定的刺激作用,但所有浓度组均没有统计学意义(图3B)。

The distance moved in each 1-min time bin during 20-min measurements period (0-min to 20-min) was plotted against the progression of the experiment.The control group (open circles) was plotted with a single pilocarpine concentration group (filled circles) in each panel.The shaded part in each panel represents the 5-min dark phase,and the non-shaded part in each panel represents the light phase.
图2 不同浓度的毛果芸香碱在整个实验过程中对斑马鱼幼鱼每分钟自发游动距离的影响
Fig 2 Distance moved by zebrafish larvae within the entire zone during all experiment measurements periodunder different concentrations of pilocarpine

A:5dpf;B:7dpf.(1)vs.Control,P<0.05.
图3 连续光照条件下不同浓度毛果芸香碱对5dpf和7dpf斑马鱼自发运动的影响
Fig 3 Effects of pilocarpine exposure on the locomotor activity of zebrafish larvae at 5dpf and 7dpf under continuous light condition

连续光照条件下毛果芸香碱对不同年龄阶段斑马鱼趋触性行为的影响在没有使用毛果芸香碱处理的对照组5dpf和7dpf的斑马鱼幼鱼都表现出一定的趋触性行为,而使用较高浓度的毛果芸香碱后5dpf和7dpf的斑马鱼幼鱼趋触性行为都有所增加。 5dpf的斑马鱼幼鱼的趋触性行为并未因为毛果芸香碱浓度的改变而产生统计学差异,但在浓度大于1 mmol/L后其中心区域游动距离(图4A)和时间(图4C)均随药物浓度增高而降低,呈现出药物依赖性的趋触性增加。相比之下,当药物浓度大于0.1 mmol/L后7dpf斑马鱼趋触性行为的改变呈现出一定的药物浓度依赖性,尤其3 mmol/L和10 mmol/L的毛果芸香碱使7dpf斑马鱼趋触性行为明显增加,即中心区域游动距离减少(P=0.005 5,P=0.000 8)(图4B)以及中心区域游动时间减少(P=0.001 4,P=0.001 8)(图4D)。

A,C:5dpf;B:7dpf.vs.Control,(1)P<0.05,(2)P<0.01.
图4 连续光照条件下不同浓度毛果芸香碱对5dpf和7dpf斑马鱼趋触性的影响
Fig 4 Effects of pilocarpine exposure on the thigmotaxis of zebrafish larvae at 5dpf and 7dpf under continuous light condition

光暗交替阶段毛果芸香碱对斑马鱼自发运动和趋触性行为的影响

毛果芸香碱对5dpf斑马鱼光照变化刺激的影响 双因素方差分析显示:F光照(1,372)=80.87,P光照<0.000 1;F毛果芸香碱 (5,372)=3.297,P毛果芸香碱=0.006 3。光照变化前的1 min内,0.1、0.3 mmol/L毛果芸香碱降低了斑马鱼幼鱼的自发运动,而1、3、10 mmol/L均增加了斑马鱼幼鱼的自发运动,但未产生统计学差异。黑暗阶段,10 mmol/L毛果芸香碱显著抑制了斑马鱼的自发运动(P<0.000 1)。在相同浓度的毛果芸香碱时,对照0.1、0.3、1 mmol/L毛果芸香碱处理的斑马鱼幼鱼在黑暗环境中较光照条件下自发运动明显增强(P<0.000 1,P<0.000 1,P<0.000 1,P=0.024 2),而10 mmol/L时黑暗环境下毛果芸香碱对斑马鱼自发运动的抑制已经完全抵消掉了黑暗本身对斑马鱼视觉刺激下的自发运动升高现象(图5A)。

毛果芸香碱对7dpf斑马鱼光照变化刺激的影响 双因素方差分析显示:F光照(1,372)=2.6,P光照=0.107 7;F毛果芸香碱(5,372)= 6.431,P毛果芸香碱<0.000 1,与毛果芸香碱对5dpf斑马鱼光照变化刺激的影响明显不同,7dpf的斑马鱼幼鱼只在黑暗刺激下且用10 mmol/L的毛果芸香碱处理时其自发运动才与对照组有明显的差异(P=0.000 3),而其他各浓度处理后光暗变化未对斑马鱼幼鱼的自发运动产生统计学的改变。3、10 mmol/L的毛果芸香碱在黑暗环境下对斑马鱼自发运动的抑制已经完全抵消掉了黑暗本身对斑马鱼视觉刺激下的自发运动升高现象(图5B)。

A:5dpf;B:7dpf.There were signicant differences between the light and dark conditions within the same pilocarpine concentration group,(1)P<0.05,(2)P<0.000 1.Versus the control group under the same lighting conditions (light or dark),(3)P<0.000 1,(4)P<0.001.
图5 光暗交替条件下不同浓度毛果芸香碱对5dpf和7dpf斑马鱼自发运动的影响
Fig 5 Effects of pilocarpine exposure on the locomotor activity of zebrafish larvae at 5dpf and 7dpf under light and dark condition

毛果芸香碱对5dpf斑马鱼幼鱼趋触性行为的影响双因素方差分析斑马鱼幼鱼中心区域游动距离F光照(1,336)=3.398,P光照=0.005 2;F毛果芸香碱(5,336)=91.7,P毛果芸香碱<0.000 1。各浓度组在光照变化前的1 min内对斑马鱼幼鱼趋触性行为的影响差异无统计学意义,在黑暗刺激下3mmol/L的毛果芸香碱显著的增加了5dpf斑马鱼的趋触性行为(P=0.000 1)。但光暗变化期间,所有浓度的毛果芸香碱处理都使得5dpf的斑马鱼幼鱼在黑暗环境下较光照环境下的趋触性行为降低(P=0.000 7,P=0.013 9,P=0.038 7,P<0.000 1,P=0.000 3,P<0.000 1)(图6A)。

双因素方差分析斑马鱼幼鱼中心区域游动时间F光照(1,341)=88.18,P光照<0.000 1;F毛果芸香碱(5,341)=5.55,P毛果芸香碱<0.000 1,光照条件下,3 mmol/L和10 mmol/L的毛果芸香碱明显的增加了斑马鱼幼鱼的趋触性行为(P=0.003 4,P=0.034 0)。但各浓度毛果芸香碱处理后5dpf的斑马鱼幼鱼在光暗交替阶段黑暗环境下的趋触性行为降低,除0.1 mmol/L之外,对照0.3、1、3、10 mmol/L的毛果芸香碱使黑暗环境下5dpf斑马鱼趋触性行为降低较其在光照条件下有明显的统计学差异(P=0.002 1,P=0.014 0,P=0.000 7,P<0.000 1,P<0.000 1)(图6C)。

毛果芸香碱对7dpf斑马鱼幼鱼趋触性行为的影响用双因素方差分析斑马鱼幼鱼在中心区域的游动距离:F光照(1,361)=6.783,P光照<0.000 1;F毛果芸香碱(5,361)=58.42,P毛果芸香碱<0.000 1。光照条件下,斑马鱼幼鱼的趋触性行为随毛果芸香碱浓度增加而逐渐增加,当毛果芸香碱浓度达到3 mmol/L和10 mmol/L时明显的增加了斑马鱼幼鱼的趋触性行为(P=0.032 2,P=0.008 6);在黑暗刺激下,毛果芸香碱浓度>1 mmol/L时随毛果芸香碱浓度增加而逐渐增加,10 mmol/L的毛果芸香碱明显的增加了7dpf斑马鱼的趋触性行为(P=0.000 1)。所有浓度的毛果芸香碱处理都使得7dpf的斑马鱼幼鱼在黑暗环境下趋触性行为较光照条件下降低,且0.1、0.3、1、3 mmol/L的毛果芸香碱在黑暗环境下对斑马鱼趋触性行为的抑制作用较光照条件下差异有统计学意义(P<0.000 1,P=0.000 7,P=0.010 3,P=0.005 4,图6B)。

双因素方差分析斑马鱼幼鱼中心区域游动时间:F光照(1,364)=5.313,P光照<0.000 1;F毛果芸香碱(5,364)=57.21,P毛果芸香碱<0.000 1。 光照条件下,3 mmol/L和10 mmol/L的毛果芸香碱明显的增加了斑马鱼幼鱼的趋触性行为(P=0.038 2,P=0.034 9);在黑暗刺激下10 mmol/L的毛果芸香碱增加了7dpf斑马鱼的趋触性行为(P=0.001 1)。所有浓度的毛果芸香碱处理都使得7dpf的斑马鱼幼鱼在黑暗环境下趋触性行为较光照降低,且对照0.1、0.3、1、3 mmol/L的毛果芸香碱在黑暗环境下对斑马鱼趋触性行为的抑制作用较光照条件下差异有统计学意义(P=0.033 2,P=0.000 3,P=0.003 2,P=0.023 1,P=0.006 8,图6D)。

A,C:5dpf;B,D:7dpf.There were signicant differences between the light and dark conditions within the same pilocarpine concentration group,(1)P<0.05,(2)P<0.01,(3)P<0.001,(4)P<0.000 1.Versus the control group under the same lighting conditions (light or dark),(5)P<0.05,(6)P<0.01,(7)P<0.001.
图6 光暗交替条件下不同浓度毛果芸香碱对5dpf和7dpf斑马鱼趋触性的影响
Fig 6 Effects of pilocarpine exposure on the thigmotaxis of zebrafish larvae at 5dpf and 7dpf under light and dark condition

讨 论

毛果芸香碱对不同年龄斑马鱼幼鱼自发运动的影响不同本研究分别考察了毛果芸香碱处理对连续光照和光暗交替条件下斑马鱼幼鱼自发运动的影响,5dpf和7dpf的斑马鱼在毛果芸香碱处理后没有表现出相同的趋势。在5dpf,斑马鱼幼鱼的自发运动随着毛果芸香碱浓度的增加先降低再升高,而7dpf斑马鱼的自发运动则呈持续性的增加,直到毛果芸香碱浓度达最高浓度10 mmol/L时斑马鱼幼鱼的活动受到抑制。5dpf的斑马鱼幼鱼与对照组相比,0.1 mmol/L时其自发运动受到最大的抑制,但在10 mmol/L药物浓度时毛果芸香碱并未对斑马鱼幼鱼的自发运动造成明显的改变,这可能与毛果芸香碱毒蕈碱样中毒症状造成的肌肉痉挛收缩相关。我们的研究中毛果芸香碱对斑马鱼幼鱼自发运动的影响与以往在环鸽研究中的结果相似[8]。在对环鸽的研究中,急性施用毒蕈碱激动剂毛果芸香碱 (1和3 mg/kg i.p.) 后,处理组在第1 h和第2 h期间引起了环鸽自发运动剂量依赖性的降低。但是与Shannon等[25]在小鼠上的研究结果不一致,他们发现用毛果芸香碱干预不会造成小鼠自发运动的改变,这可能是因为在不同的研究中,实验动物的物种、年龄以及实验干预的方式尤其时间等都不完全相同。普遍认为胆碱能神经元参与攻击,运动及认知等高级功能的调节[26];本研究中持续光照条件下较高浓度组毛果芸香碱处理的斑马鱼幼鱼自发运动增强可能与毛果芸香碱的胆碱能激活作用相关。

毛果芸香碱可在一定程度上增加斑马鱼幼鱼的焦虑水平Richendrfer等[21]将5-7dpf斑马鱼放入多孔板后,幼鱼表现出对孔边缘区域的强烈偏好,且这种偏好可以通过环境刺激进一步增强,反映出这种外来的环境刺激增加了斑马鱼幼鱼的焦虑水平。

综合中心区域的距离和时间两种指标发现,除了0.1 mmol/L组外,所有浓度毛果芸香碱处理均导致斑马鱼幼鱼趋触性随浓度和年龄的增加而增加,反映出焦虑水平的增加。相似地Liu等[19]在试验中用低于惊厥剂量的毛果芸香碱对大鼠进行腹腔注射,结果表明次于惊厥剂量的毛果芸香碱对大鼠具有致焦虑特性。我们研究中观察到毛果芸香碱的致焦虑作用与其他学者在啮齿动物模型中的结果一致,且近期已有研究进一步对毛果芸香碱诱导焦虑的机制进行了探索。普遍认为毛果芸香碱导致的焦虑可在癫痫的诊断之前或癫痫后期合并症中存在,主要与大脑皮质、海马及众多神经节和传导通路内γ-氨基丁酸能神经元受到抑制相关,GABA的缺乏或抑制会导致机体的焦虑、不安;进一步实验表明这种焦虑的产生可以被外源性胶质细胞源性神经营养因子挽救[27]。

我们首次研究了毛果芸香碱处理对斑马鱼幼鱼自发运动的影响,并观察到了毛果芸香碱对斑马鱼幼鱼的致焦虑特征,且7dpf的斑马鱼幼鱼趋触性行为的两个衡量参数较5dpf斑马鱼更一致,这可能与7dpf斑马鱼的游动能力以及自发运动行为更为完善相关。

低浓度毛果芸香碱可引起斑马鱼幼鱼的光暗应激反应,而毛果芸香碱降低了暗刺激对斑马鱼幼鱼自发运动的刺激作用4dpf时,野生型斑马鱼幼鱼便可以对光暗条件的改变做出反应,在光线变暗时表现出自发运动的增加[28-29]。在本研究中,低浓度毛果芸香碱处理组斑马鱼幼鱼在整个研究过程中对光暗变化刺激始终有反应;但当毛果芸香碱达到10 mmol/L时,黑暗刺激下斑马鱼幼鱼超运动已经被完全废除。在5dp和7dpf对照组以及0.1、0.3、1 mmol/L毛果芸香碱处理的5dpf斑马鱼组,黑暗刺激产生的超级运动具有统计学意义,而7dpf斑马鱼在任何浓度的毛果芸香碱处理下其超运动的产生均不具有统计学意义。也就是意味着,较高浓度的毛果云香碱及较完整的斑马鱼神经发育可以削弱光暗转变后暗刺激所激发的斑马鱼超运动行为,具体机制有待后续实验进一步探索。

毛果芸香碱对5dpf和7dpf斑马鱼趋触性行为的影响统一与差异共存与光照阶段相比,我们观察到所有浓度毛果芸香碱处理的5dpf斑马鱼(包括对照组)在黑暗中焦虑水平的降低,但以中心区域游动时间百分比这一指标来衡量时发现黑暗刺激下5dpf斑马鱼同时存在焦虑随毛果芸香碱浓度变化而变化的现象,高浓度时相对增加了斑马鱼幼鱼的焦虑水平。但无论以中心区域游动距离百分比还是中心区域游动时间百分比来衡量,7dpf斑马鱼的焦虑水平呈药物剂量依赖性提高。5dpf和7dpf的斑马鱼之间明显的差异可能反映了斑马鱼幼鱼早期发育阶段神经系统发育的差异。

在以往的研究中,5dpf的AB型斑马鱼幼鱼在光暗交替试验的黑暗阶段表现出趋触性行为的增加,而在黑暗阶段给予微弱的照明时,可以减少趋触性行为,表明黑暗环境比光照环境更易对斑马鱼幼鱼形成压力[8]。在课题组的多项研究中,斑马鱼对突然暗刺激的反应与Schnörr 等的发现不一致[30-31]。我们的研究中,对照组的斑马鱼在光线突然发生转变后更趋向于在测验孔板的中心区域进行游动和探索,体现出在我们的暗刺激下斑马鱼压力降低且对新环境更为新奇,趋触性下降,焦虑水平降低。这种结果之间的差异可能是由于实验设置中斑马鱼幼鱼的遗传背景、对黑暗适应程度以及温度和测试时间等多种因素不同所导致。

我们研究了不同光照条件下毛果芸香碱对5dpf和7dpf斑马鱼自发运动和趋触性行为的影响并因此发现：在同样的光照环境和毛果芸香碱药物浓度时,5dpf和7dpf的斑马鱼幼鱼自发运动并不完全一致,提示毛果芸香碱对斑马鱼幼鱼自发运动的影响可能与斑马鱼的年龄相关;且毛果芸香碱药物浓度和斑马鱼幼鱼年龄是焦虑模型中两个关键因素,在我们的研究中,10 mmol/L的毛果芸香碱对7dpf的斑马鱼幼鱼有明显的致焦虑作用。我们成功地建立了毛果芸香碱诱导的斑马鱼焦虑模型,进一步为以斑马鱼为模式动物研究焦虑症的发病机制和治疗手段提供了更为便捷的方法。

目前,可方便地利用视频跟踪对斑马鱼运动轨迹进行精确的检测统计及进一步数据分析,有助于在实验中降低成本的同时提高效率,已广泛应用于神经系统及行为学的研究评价中,视频跟踪系统的强大功能与斑马鱼模型相结合为模拟疾病的发生及探索疾病发病机制和治疗方法提供了重要的方向。