富硒酸奶的研究现状

巨家升，焦璐，周连玉*

（1.青海师范大学生命科学学院，青海 西宁 810008；2.青海省青藏高原药用动植物资源重点实验室，青海 西宁 810008；3.青海省青藏高原生物多样性形成机制与综合利用重点实验室，青海 西宁 810008；4.高原科学与可持续发展研究院，青海 西宁 810008）

硒是人体所必需的微量元素之一，具有抗氧化、抗癌、抗菌、增强免疫力等多重作用[1-2]。研究表明，人体的克山病、大骨节病、癌症、心血管病、糖尿病、机体免疫力减弱和衰老等40余种疾病均与缺硒有关[3-4]。硒的化学形态有无机态和有机态两种形式存在，无机态一般是指亚硒酸钠和硒酸钠，有机态以硒蛋白质（功能蛋白质及酶类）、硒多糖、硒核酸等形式存在。但是，无机硒的毒性很强，吸收率又低；而有机硒安全性高，易被人体吸收利用，因此补充有机硒可以作为一种安全有效的补硒手段。

许多生物能将无机硒转换为有机硒。研究表明，在培养体系中加入无机硒，微生物可以将其转化为有机硒从而利于人体吸收[5]。许多乳酸菌具有富集硒和转化硒形态的能力[6]，其独特的益生性被广泛应用于食品工业。牛奶经乳酸菌发酵后形成的酸奶价格适中、口感清新，同时具备调节肠道菌群、促进肠胃蠕动、降低胆固醇的吸收、提高机体免疫力、适合乳糖不耐受人群饮用等特点。近年来，人们越来越注重身体健康，但市场上现有的乳制品中硒含量较低（0.005 5 μg/g），明显低于生理需求量（40 μg/日）和膳食硒适宜量（50 μg/日）[7]。在牛乳或羊乳中不添加或添加硒化物作为乳酸菌生长的基质上，接入富硒发酵剂或发酵剂进行发酵培养，通过优化发酵工艺条件制备成富硒酸奶，该酸奶具有优良的理化特性和功能特性[8]。

1 富硒酸奶发酵条件

牛奶经乳酸菌发酵后形成的酸奶既有独特风味，又有丰富的营养价值与保健作用，深受广大消费者青睐。酸奶品质受原料、添加剂、发酵剂（菌株种类）、发酵温度及时间、贮藏等多种因素的影响。

1.1 添加剂生产原料、添加剂成品对酸奶品质的影响

亚硒酸钠作为硒源可应用于药品、食品等行业。张蓉等[8]在 10%脱脂复原乳中分别添加 40、50、60、70、80 μg/kg亚硒酸钠，接入富硒青春双歧杆菌和干酪乳杆菌发酵剂研制成酸奶，发现酸奶的感官总分变化趋势为先略微上升再迅速下降，当亚硒酸钠添加量大于70 μg/kg时酸奶颜色微黄、口感发涩，可滴定酸度变化不明显；结合酸奶中硒含量，确定亚硒酸钠适宜的添加量为60 μg/kg。在牛奶中加入无机硒，再通过乳酸菌发酵研制出的富硒酸奶可能存在微毒的单质硒。

为了避免单质硒引起的危害，一些研究者采用生物转化原理，如植物、酵母菌、食用菌，将无机硒转化为有机硒，制成硒粉后添加到奶液中，再利用乳酸菌发酵制成具有保健功能的新型酸奶[9-11]。汤庆莉等[9]按照1∶5的体积比混合富硒银杏叶和富硒玉米须的提取液，并制得富硒粉（总硒含量0.107 mg/L），将富硒粉以0.25、0.50、0.75、1.00、1.25、1.50 g/mL 为添加梯度发酵酸奶，试验结果发现富硒粉添加量＞0.25 g/mL时，酸奶发酵不正常，酸奶表现为淡黄、无凝乳、有乳清析出、酸味不正等现象。接着降低富硒粉添加量（0.05、0.10、0.15、0.20、0.25 g/mL），以口感和酸度为指标确定酸奶中富硒粉适宜添加量为0.10 g/mL～1.15 g/mL。曾钰鹏等[10]使用12菌型酸奶发酵剂发酵含有15%辣木叶提取液的牛乳时，通过感官评分和持水度评定富硒酵母添加量为 0.02%、0.03%、0.04%、0.05%、0.06%对酸奶的影响。富硒酵母添加量在0.02%～0.06%时持水度保持在62%～65%，酸奶的感官评分呈先上升后下降的趋势。当富硒酵母的添加量在0.04%时，感官评分最高达到了83.4。此研究说明富硒酵母的添加量对酸奶的组织状态影响较小，对感官品质影响较大。总体上，含硒物质种类、浓度对酸奶的酸度、感官品质影响较大，在持水度方面影响较小。

1.2 发酵剂（菌株种类）和接种量对酸奶品质的影响

一些研究者通过对保加利亚杆菌（Lactobacillus bulgaria）、嗜热链球菌（Streptococcus thermophilus）、双歧杆菌（Bifidobacterium longum）、嗜酸乳杆菌（Lactobacillus acidophilus）等乳酸菌进行富硒发酵培养，开发富硒酸奶[12-15]。乳酸菌代谢产生乳酸的途径有同型乳酸发酵和异型乳酸发酵，不同菌种代谢产生乳酸及其他物质存在差异。而接种量的多少，会影响乳酸菌的繁殖速度，进而对酸奶的感官品质产生影响。在辣木富硒低糖酸奶中分别接入0.08%、0.10%、0.12%、0.16%的12菌型酸奶发酵剂，持水度随接种量上升变化幅度较小（70%～72%），当接种量为0.10%时酸奶的感官评分和持水度均达到最大值，分别为85.2分和72%[10]。结合单因素和Box-Behnken试验设计优化出青春双歧杆菌和干酪乳杆菌富硒发酵剂，选择1.5%～7.5%接种量接入牛奶发酵成酸奶，接种量为1.5%～4.5%时酸奶感官评分随着接种量增加而增加，而4.5%～7.5%接种量时感官评分随其增加呈下降趋势；接种量为1.5%～7.5%时，酸度随着接种量的增加而呈上升趋势，为保证酸奶口味酸甜合适最终确定接种量为4.5%[8]。

1.3 发酵温度和时间对酸奶品质的影响

乳酸菌的生长和代谢受营养物质、温度、pH值等因素的影响。孙林超[12]使用富硒粉利用保加利亚乳杆菌与嗜热链球菌制作富硒酸奶，分别在36、38、40、42、44℃进行发酵，通过感官评分以及酸奶的酸度对其品质进行评价。结果显示在40℃下发酵的酸奶酸度适宜，组织状态良好，综合评价好，风味与一般酸奶无异。曾钰鹏等[10]使用 12 菌型酸奶发酵剂在 39、42、45、48、51℃发酵辣木富硒低糖酸奶，发现51℃时酸奶发酵不成功，其他温度均发酵成功。当温度为42℃时，酸奶感官评分与持水度最高；当温度小于或大于42℃时，持水度和感官评分持续下降，可见合适的发酵温度有利于形成良好品质的酸奶。

酸奶发酵时间与乳酸菌生长速度的快慢有关。张蓉等[8]通过单因素试验结果发现，富硒酸奶发酵时间为5 h～7 h时，酸奶的感官总分呈增加趋势，而后下降。富硒酸奶的酸度随着发酵时间的延长而增加，在发酵时间为7 h感官总分最大，为8.0，此时的酸度为76.7°T。原因是在发酵过程中乳酸菌的生长在逐渐加快，在一定时期内达到了指数生长期，致使酸奶的酸度上升明显。

Alzate等[16]以富硒菌体作为发酵剂，设定酸奶发酵时间分为12、24 h和36 h，温度为37℃～42℃，研究结果显示发酵时间为12 h时硒的含量最高，发酵温度为40℃时酸奶的组织状态最佳，口感与风味纯正。结合这些学者的研究可以发现发酵温度、发酵时间可能还与不同的菌种有关。

1.4 多因素对富硒酸奶品质的影响

诸多培养条件如硒浓度、培养温度、发酵时间、接种量和混合菌比例等都影响着酸奶的品质，各因素之间存在着相互作用。黄高明[14]采用三因素三水平正交试验优化了富硒酸奶的制作工艺，研究培养温度、富硒发酵剂接种量和加糖量对酸奶感官评分的影响。结果表明影响富硒酸奶品质的主次因素为培养温度＞接种量＞加糖量，最佳工艺条件为温度42℃、富硒发酵剂接种量7%、加糖量6%。并经方差分析发现培养温度显著影响酸奶的品质，接种量或加糖量对酸奶品质无明显作用。贾建波[17]选择L16（45）正交水平试验优化富硒酸奶发酵条件，以酸度为评价指标得出最佳发酵条件：硒粉添加量为0.075%、蔗糖添加量为7%、羧甲基纤维素钠使用量为0.20%、接种量为5%、发酵时间为3.5 h，在此条件下酸奶酸度最佳，组织状态良好，有机硒含量为43.55 μg/100 g。张蓉等[8]在单因素试验基础上，利用中心组合设计优化得到富硒酸奶的最优发酵条件：奶粉12%，蔗糖5%，低聚异麦芽糖1%，亚硒酸钠61.8 μg/kg，酪蛋白酸钠1.4%，接种量为4.5%，发酵温度为40℃，发酵时间为7 h。通过最优条件进行验证试验得到的富硒酸奶凝乳完全，呈乳白色，具有酸奶固有口味和香味，酸甜合适、组织均匀、无乳清析出，感官总分为9.1，有机硒质量比为29.2 μg/kg。此外，谢海军等[18]采用氢氧化钠法提取富硒平菇中的硒蛋白，以感官评价为指标，正交设计优化出硒蛋白酸奶发酵条件：硒蛋白添加量为4%、接种量为3%、蔗糖添加量为8%、发酵时间为6 h；研究还发现硒蛋白的添加量对感官评分的影响最大，其次为接种量，发酵时间及蔗糖添加量对其影响最小。

2 富硒酸奶的特性

牛奶中硒化合物及含量影响着乳酸菌的生长代谢，导致酸奶的一些理化性质发生变化；而乳酸菌可以将无机硒转化为不同形态的有机硒，增加酸奶中硒蛋白、硒代氨基酸、单质硒（纳米硒）等物质含量。

2.1 富硒酸奶的理化性质

酸奶的理化性质包括持水力、酸度、黏度、营养成分等指标。汤庆莉等[9]利用富硒玉米须和银杏叶制成的富硒粉并添加到牛奶中（0.1 g/mL牛奶），发酵得到富硒酸奶的水分、蛋白质、脂肪、酸度、硒含量分别为83.5%、4.6%、3.1%、0.63%～0.99%、0.107 mg/L，这些指标均符合国家标准。黄高明[14]通过在牛乳中添加亚硒酸钠制得发酵剂，利用富硒发酵剂发酵的富硒酸奶，其脂肪、蛋白质、非脂乳固体、硒含量及酸度依次为3.2%、3.1%、8.4%、0.475 μg/mL、91°T，这 5项指标均大于国家标准。使用富硒混合乳酸菌菌体与适量的复原乳获得发酵剂，刘冬等[19]用其发酵的富硒酸奶的脂肪、非脂乳固体、蛋白质、有机硒含量、酸度分别为（3.6±0.4）%、（8.6±0.3）%、（3.2±0.2）%、（17±4.5）μg/kg、（80±3）°T，富硒酸奶理化指标均符合文献[20]的相关规定。通过以上不同富硒酸奶的理化指标可见，相同指标存在差异，原因可能与发酵中所使用的乳酸菌菌种、富硒原料、发酵时间、发酵温度等因素有关，对辣木富硒低糖酸奶和普通酸奶理化特性进行比较分析，曾钰鹏等[10]发现辣木富硒低糖酸奶酸度、持水力、黏度、蛋白质以及硒含量均高于普通酸奶。黄高明[14]研制的富硒酸奶各项理化指标与普通酸奶均无差别，而有机硒达到了0.481 5 μg/mL，是普通酸奶的硒含量的约480倍。可见富硒酸奶的各项理化指标并不一定优于普通酸奶，但其含有的有机硒含量要远高于普通酸奶。

在不同的储藏条件下富硒酸奶和普通酸奶理化指标会发生不同程度的变化[18，21-22]。谢海军等[18]研究发现用硒蛋白制得的富硒酸奶和普通酸奶在冷藏9 d期间，随着时间的延长保水性、黏度都呈下降趋势；两种酸奶的乳酸菌数量、酸度都呈增加趋势。在冷藏5 d后普通酸奶的黏度显著低于富硒酸奶（P＜0.05），冷藏7 d后普通酸奶的乳酸菌数显著高于富硒酸奶（P＜0.05），整个冷藏过程中富硒酸奶的保水性都显著高于普通酸奶（P＜0.05）。宋玉卿等[22]使用含有亚硒酸钠的MRS液体培养基培养获得富硒乳酸菌并将其与牛乳混合制得发酵剂，发酵的富硒酸奶在4℃贮藏21 d期间内，随贮藏时间的延长持水率呈下降趋势；酸度、黏度均呈上升趋势；储存期内有机硒的含量达27.7 μg/kg。贮藏过程中持水率在前7 d内持续下降，黏度在9 d时达到最大值，酸度在第21天达到最大值，为97.4°T。张蓉等[8]使用固态富硒酸奶发酵剂制得富硒酸奶，在4℃储藏25 d，发现随储藏时间的延长水收缩值、酸度均呈上升趋势；活菌数、蛋白质、脂肪、非脂乳固体都呈下降趋势；有机硒含量为 29.8 μg/kg～30.1 μg/kg。富硒酸奶储藏25 d时，蛋白质、脂肪、脱水收缩值和非脂乳固体等理化指标仍符合相关规定，且活菌数达到2.88×107CFU/mL，远高于乳制品规定的乳酸菌数（≥1×106CFU/mL）。这些研究发现富硒酸奶在低温贮藏过程中保水率呈下降趋势、黏度呈上升趋势，可能是乳酸菌代谢的胞外多糖增加了酸奶的黏度[23-24]，而黏度的增加有利于提高其保水性，因此保水性较普通酸奶更高。酸度呈上升趋势与普通酸奶差异不显著，可见硒的添加会影响酸奶的部分性质。富硒酸奶中存在稳定的有机硒，硒含量远高于普通酸奶，达到了为机体补硒的目的。其他各项理化指标及活菌数虽有下降，但都符合GB19302—2010《食品安全国家标准发酵乳》[20]相关规定。

2.2 富硒酸奶中硒的形态

鉴于硒元素与硫元素的化学性质相似，无机硒经生物体的硫代谢途径转变为有机硒。乳酸菌能将无机硒转化形成纳米硒或者有机态硒。而对酸奶中硒代谢的研究报道并不多见，富硒酸奶中硒的存在方式主要为有机硒以及部分单质硒。张蓉等[8]通过截留透析的方法去除酸奶中的无机硒，根据GB 5009.93—2017《食品安全国家标准食品中硒的测定》，选用3，3-二氨基联苯胺法测定酸奶中的有机硒含量为 29.8 μg/kg～30.1 μg/kg。

硒浓度影响着酸奶中硒形态和含量，经扫描电镜鉴定硒浓度超过5 μg/g的酸奶中聚集硒纳米颗粒；而在亚硒酸钠浓度低于2 μg/g时，通过高效液相色谱-电感耦合等离子体质谱法（high performance liquid chromatography-Inductively coupled plasma mass spectrometry，HPLC-ICP-MS）检测发现乳酸菌可将亚硒酸钠或硒酸钠转化为硒代胱氨酸和甲基硒代半胱氨酸，且两者含量随着硒浓度和发酵时间而变化；然而在对照和加硒条件下经乳酸菌代谢后硒代蛋氨酸含量基本上没有变化[16]。通过模拟人体消化系统，硒浓度1 μg/g～5 μg/g 的酸奶在小肠阶段的硒生物可给性（74%～76%）明显高于在胃阶段的硒生物可给性（55%～63%）（P＜0.05）；添加硒浓度 2 μg/g的酸奶在胃消化阶段释放出180 ng/g未确定的硒化合物和152 ng/g硒代胱氨酸，而在小肠消化阶段释放出未确定的硒化合物、硒代胱氨酸、甲基硒代半胱氨酸含量依次为111、134、255 ng/g[25]。

3 富硒酸奶的生物活性

普通酸奶具有抗氧化、抗菌等活性，通过乳酸菌对牛奶基质中硒化合物的转化形成的富硒酸奶，更加具有特殊的生物活性。

3.1 抗氧化活性

谷胱甘肽过氧化物酶是由硒蛋白构成的硒酶，硒位于酶的活性中心，具有抗氧化能力，可催化过氧化氢的还原、减少活性氧产生，可与自由基相互抵消保护机体的蛋白质、DNA、染色体结构和功能不受氧化作用影响[26]。曾钰鹏等[10]分别测定辣木富硒低糖酸奶与两种市售酸奶的总抗氧化能力为5.43、3.45、3.70 U/mL。郑文玮等[27]，使用松针提取液、富硒酵母、全脂乳粉发酵的松针富硒酸乳的总抗氧化能力为22.57 U/mL，与5种市售酸奶的抗氧化能力（2.47、2.87、3.45、4.77、5.30 U/mL）相比，该酸乳抗氧化能力为市售酸奶的4倍～10倍。由此可见，富硒酸奶的抗氧化能力高于普通酸奶[28]，可能与酸奶中硒含量和硒价态有关。

3.2 解毒活性

富硒酸奶在抗病毒方面有显著的作用，尤其是对黄曲霉毒素的抵抗能力。Alsuhaibani等[29]研究发现，大鼠在感染黄曲霉毒后肝肾功能会产生严重的功能障碍和组织变化，致其体重下降，与文献研究一致[30]。继而以健康大鼠为阴性组，以被黄曲霉毒素感染的大鼠作为阳性组。阳性组在喂食富硒酸奶后，血红蛋白由（109.9±12.5）g/L 升至（124.5±13.4）g/L；红细胞压积由（27.53±2.60）%升至（33.98±4.08）%；血糖由（8.28±0.58）mmol/L 下降至（5.81±0.74）mmol/L，3 项指标与体重均恢复至正常范围，与喂食前的阳性对照有显著差异（P＜0.05）；说明富硒强化酸奶对肝脏功能的恢复有着显著作用。同时对大鼠肾脏进行了组织病理学观察，结果发现阳性组的肾脏出现了炎症和肾小球周围细胞纤维状异常增殖；而喂食了富硒酸奶的大鼠肾脏则与阴性组的健康肾脏组织相同，说明富硒酸奶能恢复大鼠肾脏功能和维持肾脏的正常组织结构，有效地降解了黄曲霉毒素。

4 展望

以牛乳、硒化物等为基质，经乳酸菌发酵后形成的富硒酸奶，具有良好的理化特性、多种营养价值以及功能特性。而富硒酸奶的理化特性与硒化物、乳酸菌、接种量、发酵时间、发酵温度等多种因素有关。一些乳酸菌在含有亚硒酸钠的MRS培养基中生长时，可以代谢产生硒多糖、硒核酸、纳米硒、硒代氨基酸等物质。而乳酸菌在含亚硒酸钠的牛乳基质中代谢产生的有机硒种类和含量，与硒代谢途径中亚硫酸还原酶、硒磷酸化物合成酶、高半胱氨酸甲基转移酶、S-腺苷甲硫氨酸合成酶、S-腺苷甲硫氨酸甲基转移酶、半胱氨酸合酶活性、谷胱甘肽还原酶、超氧化物歧化酶和硒代半胱氨酸裂解酶等酶活性有关。采用聚合酶链式反应扩增技术研究硒代谢关键基因GshR/gor、Scl、SelA、SelD的数量，以此来评价不同乳酸菌的富硒与转化硒能力，或者分析酸奶形成过程中关键基因表达的差异。