利用流式细胞仪对猕猴桃种质染色体倍性的鉴定

罗 庆， 高建有， 李洁维， 叶开玉， 莫权辉， 蒋桥生， 查满荣， 王发明， 刘世彪

(1. 吉首大学 生物资源与环境科学学院， 吉首 416000；2. 广西壮族自治区中国科学院广西植物研究所， 桂林 541006)

猕猴桃为大型木质藤本植物隶属猕猴桃科(Actinidiaceae)猕猴桃属(Actinidia)，按照最新分类修订，全球约有猕猴桃属54种，21个变种，共约75个分类单元，中国是猕猴桃的中心分布区，有52种，其中44个为特有种[1]。猕猴桃富含维生素C，营养价值高兼有抗癌等药用和保健功效[2]，深受消费者青睐，具有很高的开发价值和市场前景。

猕猴桃属植物的倍性变异十分丰富，在自然界中主要以二倍体(2n=2X=58)、四倍体、六倍体的形式出现，已确定猕猴桃属的染色体基数为29，且染色体较小，少有单倍体形式出现[3]，丰富的倍性水平为猕猴桃的遗传改良提供了优质资源[4]，为新品种、新种质的选育和开发奠定基础。目前猕猴桃主要的栽培品种为中华猕猴桃原变种(A.chinensisvar.chinensis)和美味猕猴桃变种(A.chinensisvar.deliciosa)，大部分都是通过传统的杂交育种和实生选种而来[5]，而杂交育种的前提是了解亲本的染色体倍性，以防止后代产生不育等现象，还有助于选育出品质优异、植株抗逆性强的新品种[6]，且有研究表明，染色体倍性与猕猴桃坐果率[7]、果实性状[8]、种子质量[9]等多个性状紧密相关，而猕猴桃果实性状的表现差异为品种改良和育种提供了遗传资源和可能性，因此倍性研究对猕猴桃的发展十分重要，是猕猴桃育种实践的重要环节。

目前鉴定猕猴桃染色体倍性的方法主要是染色体压片法和流式细胞仪法，前者可直接观察染色体，但操作耗时且不适宜进行大规模的倍性鉴定[10]，而流式细胞仪(flow cytometry，FCM)具有检测快、采集数据量大等优点，被广泛用于生物学、生殖学等领域[11]。黄宏文等[3]与廖光联等[6]报道了部分猕猴桃物种和品种(系)的染色体倍性，但由于猕猴桃种质资源丰富、分布较为分散等原因，仍有部分种质资源的倍性未知，导致猕猴桃倍性研究尚不完整[12]，不利于猕猴桃种质资源的开发和利用。为确定我们所收集的不同猕猴桃种质的染色体倍性，利用流式细胞仪对广西植物研究所(桂林)猕猴桃种质资源圃的11个物种，其中包括9个野生种类共50份猕猴桃种质材料进行了倍性鉴定，并探讨了染色体倍性与果实性状(果重、果毛类型和果肉颜色)之间的关系，以期为猕猴桃的育种和新品种开发奠定理论基础。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 植物材料

50份材料均于2020年7月上旬采自中国科学院广西植物研究所猕猴桃种质资源圃(桂林)，物种及品种(系)如表1所示。

表1 34份猕猴桃的染色体倍性水平与果实性状

1.1.2 仪器与试剂

流式细胞仪(美国 BD FACSCalibur)、台式高速冷冻离心机(美国 Thermo Primo R)、离心管等。解离液：0.246 g 10 mmol/L MgSO4·7H2O，0.373 g 50 mmol/L KCL，0.083 g 5 mmol/L HEPES，2 g 2% PVP-30，300 μL 0.3% Triton X-100，蒸馏水定容至100 mL，再调节pH值至7.5，置于4 ℃冰箱冷藏备用。

1.2 方法

实验参照施春晖等[13]的实验方法，于上午9：00—11：00采取新鲜的猕猴桃茎尖嫩叶，将约0.2 g嫩叶去除主叶脉后放入培养皿中，滴入2 mL解离液并用刀片快速切碎，全过程需在冰上完成。充分切碎后用400目尼龙过滤布过滤至1.5 mL离心管中，过滤2次，然后放入4 ℃冰箱中5 min。取出滤液加解离液至1 mL刻度并离心，1 000 r/min，4 ℃，5 min，弃上清液后按上述操作再离心1次。离心管中预留约0.5 mL细胞液，加入80 μL PI染料于4 ℃冰箱中染色15 min。最后用流式细胞仪检测。

2 结果与分析

2.1 流式细胞仪倍性检测

以二倍体‘红阳’为对照组，流式细胞仪设置收集有效颗粒数为10 000，其中二倍体、四倍体和六倍体的荧光强度值呈倍数递增，出峰效果如图1所示，其中二倍体‘红阳’和‘华特’在横坐标荧光通道值为200时有峰值出现，四倍体‘金圆’和六倍体‘和平1号’分别在荧光通道值为400和600时有峰值出现，峰值出现与染色体倍性关系准确，证明实验参数可靠，后续实验即以此进行。不同猕猴桃种质资源的倍性见图2。

图1 部分倍性猕猴桃的出峰图Figure 1 Peak plot of different chromosome ploidy of kiwifruit

2.2 不同猕猴桃种质资源的染色体倍性水平与果实性状

利用流式细胞仪对50份猕猴桃种质的染色体倍性检测结果与果实性状如表1、表2所示。

2.3 首次鉴定的猕猴桃种质资源倍性与果实性状

由表2可知，共有16份种质的染色体倍性为首次鉴定，二倍体9份，四倍体3份，六倍体4份，其中中华猕猴桃共5种，均为二倍体，果肉颜色丰富，分为黄色、绿色和红色；美味猕猴桃6种，四倍体2份，六倍体4份，除湘吉果肉颜色略黄，其余为绿色果肉；野生种类5种，4份为二倍体，1份四倍体。由于部分种的果实成熟较晚等原因，导致表2中数据收集不完全，有待进一步收集研究。

表2 16份猕猴桃的染色体倍性水平与果实性状

2.4 猕猴桃染色体倍性与果实主要性状的相关性

由表1与表2可知，在所检测的50份猕猴桃种质中，二倍体猕猴桃共19份，四倍体13份，六倍体18份。中华猕猴桃主要以二倍体和四倍体为主，未见高倍体，果实略小，果毛主要为短茸毛或光滑无毛；美味猕猴桃主要以六倍体为主，低倍体较少，果实较大，果肉多为绿色，多被长茸毛；野生种类中二倍体较多，无六倍体出现，果实普遍偏小，主要分为黄色和绿色果肉，果面一般光滑无毛。

研究比照了猕猴桃染色体倍性与果实主要性状的关系，结果表明染色体倍性高低与果实性状具有较明显的相关性，并且基本符合前人报道的规律[14]。在倍性与果肉颜色方面，低倍性的二倍体和四倍体果肉颜色主要为红色或黄色，如中华猕猴桃中的‘红阳’‘东红’和‘丰悦’，也有少部分二倍体是绿色果肉，如野生的革叶猕猴桃及其变种，而六倍体多为绿色果肉，如美味猕猴桃中的和平系列。猕猴桃果毛类型差异较大，低倍性的二倍体和四倍体果面多被短茸毛或光滑无毛，如中华猕猴桃中的‘红昇’和‘楚红’，而六倍体果面一般密被长茸毛或硬毛，如美味猕猴桃中常见的‘金魁’和‘海沃德’。果实重量方面，低倍体果实重量总体上低于高倍体，如二倍体和四倍体的中华猕猴桃果重一般在80 g左右，少有100 g以上的品种出现，而六倍体的美味猕猴桃果重一般在90 g左右，且100 g以上的品种较多，如‘金硕’‘皖翠’等。值得注意的是，‘楚红’为早熟品种，虽为四倍体，但其果实较小，这可能与其成熟期较早有关；美味猕猴桃中的‘湘吉’为少籽至无籽类型，所以重量较轻；毛花猕猴桃中的‘华特’是通过野生优株中选育出的大果品种，所以果实略大。

3 讨论

猕猴桃叶中含有较多的糖和黏性物质，对仪器造成了不同程度的堵管现象，鉴定过程中发现滤液的颜色与其黏性程度有较大关联，滤液颜色越深，堵管越严重，收集速度越慢，所以在选取对照组时，应选取滤液颜色较淡且倍性已知的品种，野生种类的出峰效果最好且收集速度最快。

杂交育种和高倍体诱导育种是猕猴桃的重要育种方式。杂交育种可以重新组合亲本的基因，获得亲本的优良性状，从而产生变异新植株[15]，还能产生杂种优势，获得比亲本更好的表现性。通过杂交育种已培育出了一些优良品系，如以美味猕猴桃和中华猕猴桃‘红阳’杂交选育出的新品种‘红华’，改善了‘红阳’果实偏小的性状[16]。常见的高倍体诱导育种方式有秋水仙素法、辐射诱变和多倍体诱导融合技术等[17]，Liu等[18]利用秋水仙素处理四倍体的软枣猕猴桃叶片组织，成功获得了八倍体植株。染色体多倍化是猕猴桃的重要生物学特征，染色体组增加而产生的多倍化是高等植物染色体进化的显著特征，多倍体植物的遗传和形态多样性更加丰富，并且适应生态环境的能力也更强[19]，高倍体猕猴桃的果实在耐贮性、抗逆性和增大果等方面都具有显著优势[20]。就该文材料而言，中华猕猴桃主要以低倍体为主，16个品种中共9个二倍体7个四倍体，如果通过人工诱导提高其倍性水平则可以促进其性状改良，可能增强植株抗病能力，延长果实贮藏期，增加果实质量和亩产量。美味猕猴桃的倍性水平较高，在20个品种中共有18个六倍体，如果通过倍性育种改变其倍性，可能产出更大类型的果实，且其果实成熟期比较晚，一定程度上有错开市场的优势，带来更高的市场收益。野生种类的猕猴桃果实表现不突出，倍性主要以低倍性的二倍体为主，但其长期在自然状态下生长，适应性强且具有抗逆基因，种质资源也十分丰富，这为新品种的改良和选育提供了重要的基础资源，同时也是栽培品种果实品质和抗逆性改良的重要手段[21]。

倍性是影响猕猴桃果实性状表现的重要因素之一，倍性研究对猕猴桃的市场有重要的指导意义。Li等[14]研究发现高倍体猕猴桃果肉一般为绿色、重量大于低倍体品种、且多被硬糙毛；低倍体果肉一般为黄色、一般被少绒毛。果毛可以使果实免受机械损伤和抵御一些虫害，在一定程度上是抗性增强的表现，且高倍体猕猴桃植株的藤蔓更粗壮，抗倒伏、抗病虫害等抗逆性更强，这对提高猕猴桃产量和扩大种植面积有利[22]，所以高倍体能更好地满足市场的需求[23]。研究发现，中华猕猴桃中的低倍体品种‘皖金’为黄色果肉，果毛较少且为绒毛，果重方面表现突出，平均果重达133 g，比一般六倍体果实更重，这可以作为重点品种加以研究和管培，以便进入高端猕猴桃市场。该研究50份猕猴桃材料的倍性均未出现单倍体形式，与先前报道结果[3,6]基本一致，该文新增了16份猕猴桃材料的倍性资料，很多种类都蕴藏着优质的性状。‘豫皇1号’极耐储藏，自然条件下可存放2个月，这对运输和扩大市场范围有利；野生种类中的‘奶果’为常绿种，具有重要的开发和育种价值。研究丰富了猕猴桃种质倍性资源库，为猕猴桃新品种开发和系统发育提供生物学资料。

4 结论

栽培品种中华和美味猕猴桃的倍性水平比较丰富，中华猕猴桃以二倍体和四倍体占多数，果肉颜色多为红色或黄色，果面多被茸毛或光滑无毛；美味猕猴桃以六倍体居多，果肉一般为绿色，多被长茸毛。其他物种多为二倍体，绿色果肉，短茸毛至无毛，所有种质均未出现单倍体形式。