酵母发酵对杭芍果荚生物活性及成分的影响

曹庆超， 卢钰婷， 金银哲， 林剑星， 陶 俊， 金英善,4

(1. 扬州大学 生物科学与技术学院， 扬州 225009； 2. 上海海洋大学 食品学院， 上海 201306；3. 扬州大学 园艺与植物保护学院， 扬州 225009； 4. 江苏省人兽共患病学重点实验室， 扬州 225009)

芍药(PaeonialactifloraPall.)，属毛茛科芍药属多年生草本植物，具有丰富的利用价值。芍药根作为传统中草药，富含萜类、多酚类和挥发油等化合物[1-2]，具有镇痉、镇痛、通经、利尿等功效。芍药花、种子、果肉中富含多酚类物质具有较高的抗氧化[3-4]、抗炎活性[3]。芍药籽饼粕含有15种单萜类物质[5]，籽油富含多种不饱和脂肪酸，是一种潜在、可开发利用的新型食用植物油[6]，而芍药果荚在芍药籽油加工过程中作为废弃物被丢弃，造成环境污染和资源浪费。

微生物发酵技术在活性成分提取和转化植物活性物质方面效率更高，具有很大发展潜力[7]。植物组织的微生物发酵已被用于提高中草药中生物活性化合物的提取效率或产生新的化合物[8]。已有多种微生物投入实际生产或实验室研究中，如枯草芽孢杆菌[9]、青霉菌和曲霉[10]、耶氏酵母[11]等。杭芍是我国传统药用芍药品种又是油用芍药，其结实率高，果荚资源丰富。研究以油用芍药杭芍果荚为试验材料，用3种酵母发酵后，比较酵母发酵前后生物活性及活性成分变化，为油用芍药资源的开发利用和芍药产业链的健康发展提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料

杭芍果荚采自扬州大学文汇路校区芍药园。酿酒酵母原始菌株S288C(Saccharomycescerevisiae，SC)、BY4741酿酒酵母(BY4741Saccharomycescerevisiae，BS)和扣囊复膜酵母(Saccharomycopsisfibuligera，SF)保存于扬州大学生物科学与技术学院实验室。

化学标准品及相关试剂：没食子酸(国药试剂，Lot：20180509)；芦丁(源叶生物，Lot：H24N9Z75966)；乙酰胆碱酯酶(源叶生物，Lot：J24A10P95592)；加兰他敏(源叶生物，Lot：Y28S6Y17770)；碘代硫代乙酰胆碱(源叶生物，Lot：H21M9F61841)。

1.2 方法

1.2.1 酵母发酵产物的制备

芍药果荚酵母发酵参考李冰等[12]的方法。精确称取3份芍药果荚粉末5 g，加入100 mL蒸馏水混匀，高压灭菌后，在无菌条件下分别接种酿酒酵母、BY4741型酿酒酵母、扣囊复膜酵母菌液20 mL，充分混匀后，于25 ℃、150 r/min恒温摇床发酵培养48 h。所得发酵液经离心抽滤，减压浓缩并冻干成粉末状，即得芍药果荚扣囊复膜酵母发酵产物(SF-F)、酿酒酵母发酵产物(SC-F)、BY4741型酿酒酵母发酵产物(BS-F)。未发酵产物(unfermented，N-F)即不接种菌液，经相同条件得到。

1.2.2 总酚、总黄酮含量测定

总酚含量测定采用Folin-Ciocalteu法进行，并稍作修改[13]。利用10～50 μg/mL没食子酸(gallic acid，GA)绘制标准曲线(y=0.011 5x+0.008 2，R2=0.998 3)，总酚含量以每克芍药果荚中含有毫克没食子酸当量表示(mg GA/g DW)。总黄酮含量测定采用AlCl3法[14]。以毫克芦丁(rutin，RT)当量表示每克果荚总黄酮含量(mg RT/g DW)，芦丁(5～50 μg/mL)标准曲线为y=0.012 9x-0.002 1，R2=0.999 8。

1.2.3 DPPH自由基清除活性

DPPH自由基清除活性测定参照李冰等[12]的方法，并稍作修改。抗坏血酸(Vc)作为阳性对照。

1.2.4 总抗氧化活性

采用黄佳双等[15]方法进行，稍加改进。利用每毫克Vc当量来表示每克芍药果荚的总抗氧化活性(mg Vc/g DW)。

1.2.5 总还原能力

总还原能力活性测定参照Zhao等[16]的方法，利用Vc当量(mg Vc/g DW)表示芍药果荚的总还原能力。

1.2.6 蛋白质氧化损伤保护作用

参照曹庆超等[17]的方法进行。阳性对照为没食子酸(GA)。用凝胶成像仪对电泳条带进行观察拍照，并利用Image J进行灰度区分析。

1.2.7 乙酰胆碱酯酶抑制活性

采用改进后的Ellman 法对芍药果荚发酵前后产物的乙酰胆碱酯酶(AChE)抑制活性进行测定[18-19]。加兰他敏(GT)作为阳性对照。乙酰胆碱酯酶抑制率计算公式如下：

式中：OD空白为磷酸盐缓冲液代替待测化合物的吸光度值；OD空白对照为磷酸盐缓冲液代替待测化合物、蒸馏水代替乙酰胆碱酯酶吸光度值；OD样品为待测化合物吸光度值；OD样品对照为蒸馏水代替乙酰胆碱酯酶吸光度值。

1.2.8 活性成分分析

(1)分级萃取及其抗氧化活性测定。利用分级萃取技术依次使用石油醚、乙酸乙酯、正丁醇对芍药果荚发酵前后产物进行萃取，充分富集有效活性物质。每种溶剂重复萃取3～4次，合并同种萃取层，挥干后分别进行总抗氧化活性、总还原能力测定。

(2)LC-MS成分分析。参照王智慧[20]的LC-MS检测方法，并对其条件进行一些修改。

色谱条件：采用Agilent 1200高效液相色谱仪，色谱柱(4.6 mm×150 mm，C18，5 μm，Agilent，America)，温度为25 ℃，进样量为5 μL，流速为1 mL/min。检测条件：全波长扫描(200～600 nm)。流动相为0.1%乙酸水溶液(A)和乙腈(B)。乙酸乙酯萃取层梯度洗脱程序：0～50 min， 8%B～31%B；50～55 min，31%B～100%B；55～60 min，100%B；60～63 min，100%B～8%B。正丁醇萃取层梯度洗脱程序：0～20 min，5%B～20%B；20～30 min，20%B～35%B；30～50 min，35%B～95%B；50～60 min，95%B，60～63 min，95%B～5%B。

质谱条件：ESI离子源雾化压力为15 psi，氮气流量为10 L/min，温度为250 ℃，扫描范围m/z为100～1 500 Amu。在阳离子模式下，电离电压为4 000 V，破片电压为250 V；在阴离子模式下，电离电压为3 500 V，破片电压为175 V。

1.2.9 分子对接模拟

基于芍药果荚LC-MS的分析数据，进一步利用分子对接模拟筛选和预测N-F、SF-F的潜在生理活性。分子对接采用的酶均来自RCSB数据库(https://www.rcsb.org/)，抗氧化酶包括过氧化氢酶(PDB ID：4BLC)、谷胱甘肽合成酶(PDB ID：2HGS)，抗衰老靶标蛋白酶来自RCSB数据库的SIRT 1(PDB ID：5BTR)和酪氨酸酶(PDB ID：6EI4)。配体小分子物质均来自pubchem数据库(https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/)，利用软件Chem3D 20.0进行MM2分子力学优化构象。运行AutodockTools 1.5.6软件，配体小分子物质，需要进行加氢、加电荷、检测配体的root、并搜寻与定义可旋转键；从RCSB下载得到的蛋白三维结构，作为对接所用蛋白，通过添加氢原子、计算Gasteiger电荷、合并非极性氢，将其保存为受体。运用Autodock vina 1.1.2进行分子对接，比较所有配体小分子的对接亲和力(kJ/mol)大小。

1.3 数据分析

采用GraphPad Prism 8.0进行数据统计、作图，SPSS 25进行显著性分析。所有数据均以平均数±标准差表示，并进行统计学比较。采用单因素方差分析(ANOVA)确定实验组之间的差异。

2 结果与分析

2.1 总酚及总黄酮含量

芍药果荚酵母发酵前后的总酚含量和总黄酮含量如表1所示，3种酵母发酵均能改变芍药果荚的总酚和总黄酮含量。芍药果荚经扣囊复膜酵母发酵后(SF-F)的总酚含量(338.29±0.99) mg GA/g DW显著(P<0.05)高于发酵前(N-F)的(273.94±3.86) mg GA/g DW，提高了23.49%。芍药果荚发酵后总黄酮含量最高的是SC-F(74.79±1.16) mg RT/g DW，比发酵前(64.02±0.39) mg RT / g DW提高16.82%。

2.2 抗氧化活性

通过DPPH自由基清除活性、总抗氧化活性和总还原能力，明确芍药果荚酵母发酵前后产物体外抗氧化活性的变化。DPPH自由基清除活性如图1(a)所示，当浓度为50 μg/mL时，SF-F和SC-F的DPPH自由基清除活性均显著高于发酵前，其中SF-F的清除率最高。芍药果荚酵母发酵对总抗氧化活性结果[图1(b)]显示，扣囊复膜酵母发酵后活性显著高于发酵前，提高18.54%。扣囊复膜酵母和酿酒酵母发酵均能显著提高总还原能力[图1(c)]，其中SF-F的总还原能力最高，比发酵前提高31.89%。说明3种酵母的发酵均能提高芍药果荚抗氧化活性，其中扣囊复膜酵母发酵效果最佳。

表1 芍药果荚N-F、SF-F、SC-F及BS-F的总酚、总黄酮含量

(a)DPPH自由基清除活性；(b)总抗氧化活性；(c)总还原能力。N-F(unfermented)为未发酵产物；SF-F(Saccharomycopsis fibuligera fermentation product)为扣囊复膜酵母发酵产物；SC-F(Saccharomyces cerevisiae fermentation product)为酿酒酵母发酵产物；BS-F(BY4741 Saccharomyces cerevisiae fermentation product)为BY4741型酿酒酵母发酵产物。* 表示发酵后产物与N-F相比，具有显著性差异(P<0.05)。图1 芍药果荚酵母发酵前后产物的抗氧化活性Figure 1 Antioxidant activities of P. lactiflora Pall. pods beforeand after fermentation products

2.3 蛋白质氧化损伤保护作用

在体内活性氧自由基的过度积累会引起蛋白质的氧化损伤，导致心脑血管疾病等老年病的发生[21]。通过Vc/H2O2/Fe3+体系建立体外蛋白质氧化损伤模型，对芍药果荚酵母发酵前后产物的蛋白质氧化损伤保护作用进行研究。结果如图2(a)所示，在SDS-PAGE胶中H2O2处理组的蛋白质条带明显弱于正常组，说明VC/H2O2/Fe3+体系产生的羟自由基对蛋白质造成一定程度的损伤，模型成功建立；样品组的蛋白质条带明显强于H2O2处理组，表明样品组具有清除羟自由基的作用，即对蛋白氧化损伤具有保护作用。通过蛋白质条带的灰度分析结果[图2(b)]表明，SF-F处理组的蛋白质条带灰度比显著高于其他处理组，说明扣囊复膜酵母发酵液的蛋白氧化损伤保护作用最佳。

(a)SDS-PAGE凝胶电泳条带及灰度；(b)样品的蛋白质氧化损伤保护率。Nor(normal)为正常组；Tre(treated)为 H2O2处理组；GA(gallic acid)为阳性对照没食子酸；N-F(unfermented)为未发酵产物；SF-F(Saccharomycopsis fibuligera fermentation product)为扣囊复膜酵母发酵产物；SC-F(Saccharomyces cerevisiae fermentation product)为酿酒酵母发酵产物；BS-F(BY4741 Saccharomyces cerevisiae fermentation product)为BY4741型酿酒酵母发酵产物。BSA蛋白大小为66 ku。* 表示发酵后产物与N-F相比，具有显著性差异(P<0.05)。图2 芍药果荚发酵前后产物蛋白氧化损伤保护作用Figure 2 Protective effects of oxidative damage of protein in P. lactiflora Pall. pods before and after fermentation products

2.4 乙酰胆碱酯酶抑制活性

乙酰胆碱酯酶是生物神经传导中的一种关键酶，能够催化胆碱能突触间隙的神经递质乙酰胆碱水解，终止信号刺激，阻断神经信号在体内的正常传递。乙酰胆碱酯酶抑制剂是一种能对乙酰胆碱酯酶进行可逆性抑制的物质，是目前临床上最为广泛使用的阿尔茨海默病治疗药物。芍药果荚酵母发酵前后产物(1.0 mg/mL)对乙酰胆碱酯酶的抑制作用如图3(a)所示，只有扣囊复膜酵母发酵后乙酰胆碱酯酶的抑制作用比发酵前显著提高，较发酵前提高107.24%，并具有浓度依赖性[图3(b)]，当浓度为1.0 mg/mL时，乙酰胆碱酯酶抑制活性(60.25%±4.09%)相当于10 μg/mL加兰他敏(阳性对照)的抑制活性(62.54%±2.40%)。说明芍药果荚扣囊复膜酵母发酵产物有望作为抗阿尔茨海默病的药物或保健品。

(a)酵母发酵前后产物的抑制作用；(b)不同浓度N-F、SF-F的抑制作用。GT(galanthamine)为阳性对照加兰他敏；N-F(unfermented)为未发酵产物；SF-F(Saccharomycopsis fibuligera fermentation product)为扣囊复膜酵母发酵产物；SC-F(Saccharomyces cerevisiae fermentation product)为酿酒酵母发酵产物；BS-F(BY4741 Saccharomyces cerevisiae fermentation product)为BY4741型酿酒酵母发酵产物。* 表示发酵后产物与N-F相比，具有显著性差异(P<0.05)。图3 芍药果荚发酵前后产物乙酰胆碱酯酶抑制作用Figure 3 Inhibition of acetylcholinesterase produced by P. lactiflora Pall. pods before and after fermentation products

2.5 活性成分含量与抗氧化活性、乙酰胆碱酯酶抑制活性之间的相关性

通过软件SPSS 25对芍药果荚发酵前后的活性成分含量及其抗氧化活性、乙酰胆碱酯酶抑制活性进行相关性分析，所得各变量间的Pearson相关系数以及显著性(双侧)检验结果如表2所示。活性成分含量与活性之间均存在相关性，其中总酚含量与DPPH自由基清除活性(0.913)、总抗氧化活性(0.921)、总还原能力(0.978)、蛋白质氧化损伤保护作用(0.908)和乙酰胆碱酯酶抑制活性(0.800)之间的相关系数均在0.8以上，表明存在极强相关性。相比之下，总黄酮含量与抗氧化活性、乙酰胆碱酯酶抑制活性之间的相关系数多为0.4～0.6，显示中等程度相关。

表2 芍药果荚发酵前后的活性成分含量与抗氧化活性、乙酰胆碱酯酶抑制活性之间的相关性

2.6 扣囊复膜酵母发酵后成分变化

通过体外抗氧化活性、蛋白质氧化损伤保护作用和乙酰胆碱酯酶抑制活性结果显示，扣囊复膜酵母发酵液可显著提高芍药果荚的生物活性。因此，进一步对SF-F和N-F按照极性从小到大依次进行分级萃取，并对萃取物进行总抗氧化活性及总还原能力测定，如图4所示。结果表明，抗氧化活性物质主要存在于乙酸乙酯层和正丁醇萃取层，且扣囊复膜酵母发酵后，两个萃取层的活性均显著提高。因此，进一步利用LC-MS分析比较乙酸乙酯萃取层和正丁醇萃取层的活性成分变化。

(a)总抗氧化活性；(b)总还原能力。N-F(unfermented)为未发酵产物；SF-F(Saccharomycopsis fibuligera fermentation product)为扣囊复膜酵母发酵产物。* 表示SF-F、N-F相应萃取层相比，具有显著性差异(P<0.05)。图4 扣囊复膜酵母发酵前后产物分级萃取后萃取级分的抗氧化活性Figure 4 Antioxidant activities of extraction stages of P. lactiflora Pall. pods before and after fermentation

如表3所示， N-F乙酸乙酯层主要有6个峰，其中没食子酸、槲皮素和1,2,3,4,6-O-五没食子酰-β-D -葡萄糖是主要活性成分，超过总量的85%；正丁醇层主要有10个峰，其中没食子酸、槲皮素-3-O-葡萄糖苷、槲皮素是主要组成部分，超过总量的84%(表4)。而扣囊复膜酵母发酵液(SF-F)乙酸乙酯层和正丁醇层只有4个峰，主要成分均为没食子酸，是总量的94%以上，比发酵前分别提高了175.02%(乙酸乙酯层)、204.62%(正丁醇层)。

表3 芍药果荚扣囊复膜酵母发酵前后乙酸乙酯萃取物的成分变化

表4 芍药果荚扣囊复膜酵母发酵前后正丁醇萃取物的成分变化

结合前期生物活性结果，推测芍药果荚中的最主要生物活性物质是没食子酸，且经扣囊复膜酵母发酵后没食子酸含量显著提高，这可能就是SF-F的生物活性显著高于N-F的原因。此外，推测扣囊复膜酵母发酵过程中，一些大分子物质如1,2,3,4,6-O-五没食子酰-β-D-葡萄糖、2″-O-没食子酰基金丝桃苷等被分解，转化为小分子的没食子酸。

2.7 分子对接模拟

分子对接可以通过研究分子间相互作用从而预测分子间的结合能力。分子对接亲和力常数越小，配体与受体蛋白质结合更稳定，表明该药物成分与关键蛋白质具有强结合力。分子对接模拟为活性蛋白酶与化合物的相互作用方式给予一定的解释，为进一步研究小分子药物奠定理论基础。研究基于分子对接模拟对芍药果荚活性成分的体内抗氧化、抗衰老潜在活性进行预测。将LC-MS分析得到的15种芍药果荚活性物质与4种抗氧化、抗衰老关键蛋白(过氧化氢酶、谷胱甘肽合成酶、SIRT 1、酪氨酸酶)进行分子对接，结果如表5所示。芍药果荚相关活性成分均对4种关键蛋白酶有一定的对接亲和作用，其中以1,2,3,4,6-O-五没食子酰-β-D-葡萄糖、槲皮素-3-O-β-D-葡萄糖-7-O-β-D-龙胆双糖苷、槲皮素-3-O-葡萄糖苷、2″-O-没食子酰基金丝桃苷等活性物质的分子对接亲和力均较高，表明芍药果荚存在潜在的体内抗氧化、抗衰老活性。

表5 芍药果荚活性成分与抗氧化、抗衰老相关蛋白酶的分子对接

3 讨论

微生物发酵技术可以改变中药原有的性质，从而提高疗效，减少毒副作用，扩大适应证。芍药种子富含多种酚类、萜类等物质[17,22]，为寻找有效提高活性物质提取率的微生物，选取酿酒酵母、扣囊复膜酵母、BY4741型酿酒酵母等3种酵母菌对芍药果荚进行发酵。酿酒酵母作为生物技术行业最常见酵母，应用广泛[23]；扣囊复膜酵母广泛存在于各种酒曲中，具有高糖化力、高蛋白酶活性和酯生产能力[24]，同时用于植物成分提取[12]；BY4741型酿酒酵母则多与萜类化合物的合成相关[25]。研究以抗氧化活性变化来衡量并筛选发酵后活性最佳的酵母菌，并进一步分析其发酵前后的化学成分变化。由图1～3可知，扣囊复膜酵母发酵芍药果荚后，抗氧化活性提升最显著，发酵性能最佳。

多酚类物质和黄酮类化合物是植物重要的次生代谢产物，分布广泛，其含量在一定程度上能反映植物的各项特性和特征[26]。周英彪等[27]利用酿酒酵母、醋酸杆菌、乳酸杆菌对荔枝酵素进行发酵，并利用HPLC检测发酵前后酚类物质的变化，结果表明，荔枝果汁经混菌优化工艺发酵后，荔枝酵素的总酚含量是荔枝果汁的1.54倍，果汁检出的14种酚类化合物中13种，经发酵后均被完全转化成其他酚类物质。施敏等[28]利用短刺小克银汉霉发酵将芍药苷转化为芍药内酯苷，且转化率最高可达43.00%±2.73%。芍药果荚经酵母发酵后，总酚、总黄酮含量和抗氧化活性都有所提高，其中扣囊复膜酵母发酵产物活性最高，这与李冰等[12]的结果基本一致。LC-MS分析结果发现，扣囊复膜酵母发酵后，芍药果荚中1,2,3,4,6-O-五没食子酰-β-D-葡萄糖、槲皮素-3-O-葡萄糖苷、槲皮素-3-O-β-D-葡萄糖-7-O-β-D-龙胆双糖苷等大分子转化为小分子没食子酸；芍药籽饼粕经扣囊复膜酵母发酵后白藜芦醇苷转化为白藜芦醇[17]，推测扣囊复膜酵母发酵可能起到类似单宁酶作用[29]。

芍药果荚为芍药生产中的副产物，目前作为垃圾被丢弃。研究首次揭示了酵母发酵对芍药果荚成分和生物活性的影响，并利用LC-MS、分子对接分析确定了主要活性成分。研究结果表明，芍药果荚经扣囊复膜酵母发酵后，总酚含量、抗氧化活性及乙酰胆碱酯酶抑制作用均较发酵前显著提高。LC-MS分析表明，经扣囊复膜酵母发酵后，芍药果荚中1,2,3,4,6-O-五没食子酰-β-D-葡萄糖、槲皮素-3-O-β-D-葡萄糖-7-O-β-D-龙胆双糖苷、槲皮素-3-O-葡萄糖苷、2″-O-没食子酰基金丝桃苷等大分子物质分解转化为小分子没食子酸，使发酵后的果荚中没食子酸含量显著提高。没食子酸可以利用Nrf2通路介导MDA活性下降，SOD、CAT活性上升从而改善小鼠氧化应激[30]，是一个很好的抗氧化剂。扣囊复膜酵母发酵可使芍药果荚成为生产没食子酸的天然资源，简便且易得，以废变宝，降低生产成本。同时分子对接结果预测到芍药果荚含有体内抗氧化、抗衰老活性物质，而扣囊复膜酵母发酵后芍药果荚活性物质种类减少对生物活性的影响及芍药果荚扣囊复膜酵母发酵物的体内生物活性有待进一步研究。