猪传染性胸膜肺炎防控及净化策略探讨

赵月桥 ，胡耀方 ，于学祥 ，陆时娟 ，王久红 ，李文涛 ，何启盖

（1.华中农业大学动物科技学院动物医学院，湖北 武汉 430070；2.广西扬翔股份有限公司，广西 贵港 537000；3.湖北金林原种畜牧有限公司，湖北 武汉 430200）

猪传染性胸膜肺炎（Porcine Contagious Pleuropneumonia，PCP）是由胸膜肺炎放线杆菌（Actinobacillus pleuropneumoniae，APP）感染引起的一种传播迅速、传染性强的猪呼吸道传染病。最急性型和急性型时，病猪无先兆症状，突然死亡。耐过猪只可能转归为亚临床感染，不表现临床症状，但持续排出病菌，导致感染猪群中很难控制和根除该病（Bosse等，2002）。

1 病原学

胸膜肺炎放线杆菌（APP）是一种典型球杆状菌体、有荚膜的革兰氏阴性菌。根据体外生长时是否依赖烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（NAD），APP可分成生物Ⅰ型（NAD依赖型）和生物Ⅱ型（NAD不依赖型）两种。根据细菌细胞壁外荚膜中荚膜多糖（CPS）的成分不同，APP分为19个血清型，但仍有一些菌株无法分型（Stringer等，2021）。

2 流行病学

在大多数案例中，猪传染性胸膜肺炎是由亚临床感染的猪只排菌引起（Klinkenberg 等，2014）。本病一年四季皆可发生，但在冬春（寒冷）季节发病率高；各阶段猪只均对APP易感，但90日龄左右猪只最为易感。APP在猪群内主要是通过口腔或是鼻腔分泌物接触传播，或通过0.5～3 μm大小的气溶胶液滴在2 m内短距离传播。根据Zhang（2019）和李倩倩（2022）等人对国内规模化猪场细菌性疾病的流行病学调查显示，近十年内APP的流行率约为0.3%～2.7%，且呈逐年上升趋势。

3 临床症状

根据临床症状，猪传染性胸膜肺炎病程包括最急性型、急性型和慢性型三类。

最急性型：猪只突然发病，体温迅速升高至41.5℃，精神沉郁、厌食等。病猪虚弱，鼻部、耳朵、四肢皮肤发绀。在疾病后期，出现严重呼吸障碍并张口呼吸，呈犬坐姿势且肛温下降。死亡前，通常口腔和鼻腔排出有大量泡沫状带血的分泌物。最急性型从感染到死亡，病程最短只有6 h。

急性型：同一或不同猪圈的多头猪只出现感染，体温迅速达到40.5～41℃左右，出现皮肤发红、精神沉郁、食欲废绝等症状。病猪出现明显的呼吸困难、咳嗽等呼吸系统症状，有时张口呼吸。从感染到死亡，病程在48 h左右。

慢性型：发生在急性症状消失后、治疗或预防措施没有完全控制感染时，或中等毒力血清型菌株引起的感染。表现为轻微发热或不发热，并出现不同程度的持续性或间歇性咳嗽。同时，因食欲减退导致增重率降低（张立昌，2001）。

4 病理学诊断

4.1 病理剖检变化

该病病变程度取决于猪只感染菌株的毒力和机体的载菌量。猪传染性胸膜肺炎的病理变化局限于胸腔。病猪患有纤维素性出血性或纤维素性坏死性肺炎，且以肺叶和小叶双侧性的纤维性胸膜肺炎为特征性病变。弥漫性纤维性渗出物分布在胸膜和肺浆膜表面。病程较长的猪，可见胸腔积液、浑浊，有时混有血液，肺与胸腔高度粘连（张立昌，2001）。

4.2 病理组织学变化

在该病的早期，肺脏组织学变化包括出血、坏死，并有纤维素性渗出物。局部嗜中性粒细胞浸润。病程后期可见巨噬细胞浸润、坏死灶周围有大量的白细胞，肺泡中有变性的肺泡上皮细胞、巨噬细胞及嗜中性粒细胞，血管严重变性导致出血，扩张毛细血管中可见红细胞、血小板栓塞及纤维素性渗出（Bosse等，2002）。

5 危害

主要包括急性暴发时引起的猪只突然死亡，慢性、隐形感染时导致的生产、治疗成本增加，增重率及出栏重下降。此外，该病主要导致猪只肺脏损伤，呼吸机能受损，可能易继发其他疾病。

6 诊断

6.1 病原学诊断

6.1.1 样品采集

（1）肺脏、气管和扁桃体的采集 优先选择发病后死亡猪只或者具有咳喘等明显症状的猪只进行解剖。保定猪只，充分放血后，打开猪只咽喉部、胸腔，钝性分离肺脏，保证肺脏及气管的完整性。扁桃体位于猪只口腔上颚的后部，取气管时可以一同取下。

（2）鼻拭子的采集 可选取有咳喘等症状的猪只进行采集。鼻腔拭子为活体监测常用样品，但存在其他细菌污染的情况，导致APP分离难度较高。保定猪只，先将鼻部明显的污物清理后，再用棉签拭子或者植绒拭子伸入猪只鼻腔内4～5 cm位置，将拭子停留直到猪只打喷嚏后取出拭子，放在EP管中保存，尽可能两边鼻腔都采集。

血液样品不宜作为病原检测样品，可作为抗体检测样品。

6.1.2 病原分离

（1）肺脏、气管 选择肺脏的病变交界处，用酒精消毒表面，使用无菌剪刀在消毒区域剪出2 cm×2 cm的组织块，用内表面在巧克力琼脂平板上划线接种并培养。

用无菌组织剪在气管近肺脏端剪开缺口，将无菌接种环伸入气管内，粘到黏液后取出在巧克力琼脂平板上划线。

（2）扁桃体 将扁桃体表面用酒精棉擦拭消毒，用无菌剪刀从侧面剪开扁桃体，用暴露出的截面在巧克力琼脂平板上涂抹。

（3）鼻拭子 用灭菌镊子将鼻拭子在巧克力琼脂平板上按压涂抹。

为了观察菌株的溶血性和“卫星现象”，按照无菌操作标准，将样品接种到血琼脂表面，同时将金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus，S. aureus）作交叉划线接种，于37℃含5%二氧化碳的恒温箱中分离，随后用巧克力琼脂平板和PPLO琼脂平板进行传代培养。

6.1.3 病原鉴定

APP于血琼脂培养基划线接种培养24～48 h后，菌落形态呈现露珠样，直径约1～2 mm。可产生β溶血环和“卫星现象”（即APP的菌落大小与靠近金黄色葡萄球菌菌落的距离呈反比关系）。

革兰氏染色可见APP呈现革兰氏阴性小球杆菌，继代培养APP菌落可呈现多种形态，早期偶见丝状形态。

6.1.4 判定

具有以下四个特点，即可初步判定为APP：

（1）革兰氏染色镜检呈现革兰氏阴性小球杆菌或多形态；

（2）于血琼脂平板上生长具有溶血现象；

（3）生长依赖Ⅴ因子，即存在“卫星现象”；

（4）生化特性：尿素酶试验为阳性，能分解D-木糖，不分解棉子糖、阿拉伯糖。

6.2 血清学诊断

6.2.1 猪胸膜肺炎放线杆菌 Apx抗体检测

可参考刘建杰（2004）、梁望旺（2004）及Jung（2019）等 建立的ELISA方法分别检测ApxI、ApxII和ApxIII毒素抗体。

6.2.2 猪胸膜肺炎放线杆菌ApxⅣ抗体检测

用商业化试剂盒ApxⅣ-ELISA检测猪血清样品中APP ApxⅣ抗体。APP分泌的外毒素ApxIV毒素具有种属特异性，且ApxIV只能在APP感染猪只体内产生，体外培养的APP不分泌此毒素（Jacobsen等，1996）。灭活疫苗免疫猪的ApxⅣ抗体为阴性，而感染猪的ApxⅣ抗体为阳性，因此，检出ApxIV抗体，可区分灭活苗免疫猪与自然感染猪。如果基因缺失活疫苗是缺失了ApxIV基因，商业化ApxⅣ-ELISA也可实现鉴别诊断。

LPS-ELISA试剂盒可检出APP抗体，但无法实现鉴别诊断。

6.3 聚合酶链反应（PCR）检测

6.3.1 模板制备

菌落：挑取可疑菌落于pH 7.2、0.01 M PBS中，制成约108CFU/mL菌悬液（液体稍浑浊）。离心后取沉淀加入50 μL PBS，-20℃冷冻15 min，取出立即置100℃水浴中煮沸5 min。重复冻融、煮沸两次。10 000 g离心5 min，取上清，可作为模板直接扩增。

组织样品及鼻拭子：将0.5～1 g组织（取病变交界处、深处的肺脏组织，扁桃体组织）剪碎，加入1 mLPBS缓冲液，匀浆。鼻拭子在1 mLPBS缓冲液中反复震荡，以充分释放细菌。按照商品化试剂盒推荐方法提取总核酸。

6.3.2 多重PCR检测

对分离的菌株和核酸样品，可采用陈凡等（2004）建立的可对胸膜肺炎放线杆菌生物Ⅰ 型13个标准菌株中的8个血清型进行区分的多重PCR方法，直接用于临床病料的检测，缩短检测时间。Oliver等（2021）基于ApxIV基因和血清特异性荚膜基因建立多重PCR方法，能快速鉴定已知的19个血清型。

6.3.3 荧光定量PCR检测

杨利等（2010）建立了实时荧光定量PCR方法检测APP，能特异性地检测出APP感染，还能定量反映APP在不同组织中的分布差异。2021年，冯逸雪建立了检测胸膜肺炎放线杆菌、副猪格拉瑟菌和肺炎支原体的多重荧光定量PCR方法，可检测鼻拭子、环境样品（水槽、料槽和生产区土壤）和肺脏样品中的APP核酸。

7 预防与治疗

良好的环境管理可将疫病暴发的可能性降至最低，包括保持适宜的环境温度、减少刺激、根据不同季节适当的通风、全进全出和适当的饲养密度以及更早的断奶日龄

（＜21 d）。

对于APP阴性的猪群，应严格采取生物安全措施，防止外源APP的引入。应从没有临床症状和病变且APP抗体阴性的猪场引种，避免引入带有APP菌株的猪只。

针对感染猪的治疗，选择抗菌药物要根据其最低抑菌浓度（MIC）及其药代动力学和药效学（PK/PD）特性为基础。最好使用对分离菌敏感性的药物。通常使用氟苯尼考、替米考星、恩诺沙星等药物。群体给药方式可使用泰乐菌素1 kg/t和强力霉素1.5 kg/t拌料饲喂，连用7 d；个别重症发病个体可肌注头孢噻呋与解热镇痛药物。受威胁猪群可进行药物预防，具体是替米考星400 g/t并强力霉素1 kg/t，拌料饲喂，连用5～7 d（陈琼等， 2015）。

个体治疗以肌注为主。由于病猪食欲下降，拌料给药效果较差。病程早期使用抗生素治疗才能见效，可使死亡率下降。对于感染严重或病程过长的猪只，即使治疗也可能无法恢复健康（肺脏已与胸腔粘连），应实施淘汰。

8 净化策略

8.1 净化策略

需要采取综合措施，核心技术是免疫预防、药物治疗、淘汰感染猪、引种检疫和全进全出等5个措施。具体净化方案依据猪群感染状态来确定。

8.2 感染状态普查

8.2.1 采样技术

病原学样品：用一次性植绒拭子伸入猪只鼻腔一定深度，在鼻腔中稍作停留，猪只有喷嚏反射时取出拭子，放入无菌EP管中保存，每侧鼻腔分别用不同拭子采集。

血清学样品：使用无菌注射器采集猪只血液，每份血液样品不少于3 mL。样品可放于4℃静置析出血清，无菌分离血清后分装于无菌EP管中保存在4℃，长期保存可放置于-20℃保存。

样品运输：当天采集的样品应24 h内检测，若无条件当天检测可置于4℃短期保存。

8.2.2 抽样数量

按照估算比例的样本量公式设计抽样量，根据感染抗体阳性率高低，确定具体净化方案。

8.3 种猪场分类标准

种猪场根据感染情况，分为重度感染场、中度感染场和轻度感染场和阴性场，如表1。

表1 不同程度感染场ApxIV抗体阳性率、APP核酸阳性率、发病率和死亡率

8.4 净化方案的确定

重度感染场：不具备净化条件。执行药物治疗措施，待猪群不出现死亡后、生产指标正常，开始净化。

中度感染场：执行药物干预后，使用疫苗免疫。实行强化免疫—检测淘汰—补充阴性后备猪—监测与认证维持的分步净化方案。

轻度感染场：可直接实行检测—淘汰—监测与认证维持的净化方案。

阴性场：依赖生物安全措施和全进全出，加强生猪转群、销售环节的车辆消毒；只引入抗体阴性猪。

8.5 强化免疫阶段

8.5.1 疫苗选择

目前市场上主要有亚单位疫苗和灭活苗两种。

亚单位苗主要以APP外毒素为主要成分，辅以外膜蛋白等因子为抗原。国外已有默沙东猪胸膜肺炎放线杆菌亚单位灭活疫苗，该疫苗成分包含APP菌株几种毒力因子：外膜蛋白（OMP）和3种毒素（ApxⅠ、ApxⅡ、ApxⅢ），可提供较好的交叉免疫保护。

通常采用灭活疫苗预防PCP，我国先后用免疫性良好的APP研制成功多种灭活疫苗，经现场试验证明疫苗是安全有效。目前有中国农业科学院兰州兽医研究所研制的APP（1、3、7型）三价灭活苗和华中农业大学等研制的APP（1、2、7型）三价灭活苗等获得国家新兽药注册证书，已经商业化生产和推广使用。但由于灭活后APP的交叉保护力比较弱，使用某几个血清型的多价疫苗不能抵抗所有血清型的APP的攻击，因此用从当地分离的APP菌株制备而成的灭活苗，对当地流行株的防控比较好。

8.5.2 免疫程序

采用ELISA方法监测群体的感染时间，根据疫苗免疫后抗体的产生时间，制定合理的免疫程序。通常情况下，仔猪35—40日龄进行第1次免疫接种，4周加强免疫1次。母猪产前6周和2周各注射1次，以后每6个月免疫1次。

8.5.3 抗体水平评估

免疫后3周检测ApxⅡ毒素抗体，抗体效价≥1∶1 280可具有完全保护效力。90%以上的猪群产生合格抗体，认为群体免疫合格。

8.5.4 临床评估

通过强化免疫后，猪群应无猪传染性胸膜肺炎临床症状。

8.6 检测与淘汰阶段

8.6.1 商品猪隔离淘汰

每6个月检测抗体，每次抽样检测10%～20%的猪只。将APP抗体阳性的猪只与阴性猪只隔离到不同栏舍饲养，防止交叉感染。逐步淘汰阳性猪只，降低阳性猪只比例。同时也要加强阴性群的隔离与监测，最后建立APP阴性猪群。

8.6.2 种猪群检测与淘汰

种猪群APP抗体阳性率小于10%时，检测到抗体阳性猪可直接淘汰，采取药物治疗，直至出栏；若有可疑样品时，可对样品复检，或者在两周后抽样检测，若依旧为可疑，可直接淘汰。

8.6.3 后备种猪检测与淘汰

可分别在5月龄（或进入后备舍前）和配种前1个月对选择留种的后备种猪采集血清样品，检测ApxⅣ抗体，如为阴性，即可作为种猪使用；如检出APP ApxⅣ抗体阳性或出现两次可疑阳性结果，应作淘汰处理。

8.7 强制净化阶段

（1）对全群猪群进行APP ApxⅣ ELISA普检，淘汰全部抗体阳性猪只。

（2）在淘汰全部APP ApxⅣ抗体阳性猪1个月后，按10%的比例对母猪群采血。种公猪全体采血，进行抗体检测。

（3）如抽检种猪群胸膜肺炎放线杆菌ApxⅣ抗体全部阴性可视为猪传染性胸膜肺炎假定阴性群。

8.8 假定净化阶段

在阳性猪淘汰1年后，种猪群持续保持胸膜肺炎放线杆菌ApxⅣ抗体阴性，且猪群生产持续平稳，便认定猪群达到假定净化阶段。

8.9 净化场的评估

8.9.1 评估时间

达到“假定净化阶段”后，按照免疫净化标准、非免疫净化标准进行净化场评估。

8.9.2 免疫净化标准

（1）在生产母猪群和后备种猪群中按比例采集血清样品，抽检Apx毒素抗体，合格率不低于

90%；

（2）在种公猪群、生产母猪群和后备种猪群中按比例采集血清样品，抽检APP ApxⅣ抗体，检测结果均为阴性；

（3）连续两年以上无临床病例。

8.9.3 非免疫净化标准

种公猪、生产母猪和后备种猪抽检，APP ApxⅣ 抗体检测均为阴性，疑似病例或者屠宰育肥猪的扁桃体不能分离到APP。停止免疫两年以上，无PCP临床病例。8.9.4 评估抽样

评估抽样方法见表2。

表2 评估抽样

8.10 净化场的维持阶段

8.10.1 免疫

种猪场要选用合格的猪胸膜肺炎放线杆菌疫苗制订合理有效的免疫程序，并严格执行。

8.10.2 监测

（1）种猪群监测：每年监测阴性种猪群的APP ApxⅣ 抗体水平。置信度95%，预期流行率3%。保证基础群、后备群维持阴性状态。

（2）后备猪群监测：在后备猪选留时进行APP ApxⅣ抗体和APP核酸检测，确保转入种猪群的猪只ApxⅣ抗体为阴性并且APP核酸为阴性，即无APP感染猪只。后备猪入群必须逐头检测。

8.10.3 引种检疫

（1）引种时严格检疫监测。逐头检测种猪，确保猪只ApxⅣ 抗体为阴性和APP抗原阴性后才能引进。

（2）建造独立隔离舍，引进后隔离饲养45 d以上，经检测APP核酸和抗体双阴性后才可混群饲养。

8.10.4 疑似病例诊断

要及时剖检疑似病死猪，检测APP病原，如果病原检测为阳性，则检测同群接触猪只。若同栏猪均带菌，建议全部淘汰。

8.11 综合生物安全措施

8.11.1 合理的猪场选址

按《标准化规模养猪场建设规范》（NY/T 1568-2007）规定执行，避免猪舍的进风口与出风口的空气交叉混合，避免细菌在栋舍之间经空气传播，交叉污染。

8.11.2 生产模式

参照《集约化猪场防疫基本要求》（GB/T 17823-2009）执行。实行自繁自养、全进全出、提前断奶及“两点式”或“三点式”的生产模式，阻断猪场间、猪群间、批间、引种、转场等环节的疫病传播。

8.11.3 饲养管理

严格依照《规模猪场生产技术规程》（GB/T 17824.2）执行，加强饲养管理，减少应激。做好通风、保温、适宜的饲养密度。种猪场的净道与污道要分开。母猪分胎次饲养、分阶段饲养，隔离、阻断疫病传播。科学规范用药，种猪禁用皮质类固醇类药物。

8.11.4 消毒措施

严格对人员、物品、用具、车辆、猪舍内外环境以及粪污等进行消毒。按《猪场消毒技术规范》（DB13/T 991-2008）执行。

8.11.5 无害化处理措施

（1）病死猪及母猪所生产的弱仔猪、死胎、流产胎儿按农医发〔2017〕25号《病死及病害动物无害化处理技术规范》的规定处理；

（2）粪污无害化处理严格按《畜禽粪便无害化处理技术规范》（NY/T 1168-2006）的规定执行。

8.11.6 有害生物防治措施

禁止在猪场内饲养犬、猫等其他动物。每6个月至少开展1次全方位彻底灭鼠。定期杀虫、防蝇。

8.11.7 其他生物安全措施

（1）保障独立、隔离的公猪站的生物安全，加强人工授精检测与管理，防止精液被污染而传播；

（2）加强生产流程管理。重点在容易转阳的阶段，全部清空1～2批，彻底消毒，空栏；

（3）保持净化工作的连续性。

8.11.8 档案管理

（1）严格做好免疫程序记录、兽药使用记录、圈舍消毒记录、生产记录、病死猪无害化处理记录、兽医诊疗记录、饲料记录、饲料添加剂使用记录、防疫监测记录、运输车辆记录、销售记录和粪污无害化处理记录等；

（2）记录保存不少于2年。

9 挑战

由于APP可在机体具有低水平抗体或亚临床感染的情况下定植于扁桃体隐窝中，常规检测可能为“假阴性”，导致猪群中APP持续流行。因此，如何提高检测敏感性，研发靶向扁桃体中APP的药物，是实施净化面临的挑战。