禽流感与新城疫血凝试验检测方法

李宇刚

（山东省威海市环翠区动物疫病预防控制中心，山东 威海 264200）

0 引言

血凝抑制试验中主要使用4单位抗原（4HAU）作为诊断液，4HAU的配置自然就成为了整个试验中的重要环节之一，并且精确性对血凝抑制试验的结果会造成直接影响，往往4HAU的浓度与HI抗体效价成反比。使用血凝试验检测的准确性会对4HAU配置的准确性造成直接的影响，为避免血凝试验检测的不准确，需要进一步使用回归检验试验对血凝试验的结果进行验证。也正是因为现存的检测方式需要对血凝试验、回归检测试验进行多次验证才造成诊断禽流感、新城疫的效率低下。

1 目的

希望通过本次研究设计一种禽流感和新城疫的血凝试验检测方法，有效避免现如今检测技术存在的不足，不再使用常规的血凝试验方式，改用回归检测试验的方式在观察血凝效价的基础上对禽流感、新城疫血凝效价进行计算，并且最终获得的结果是完全一致的[1]。实践证明，使用本次设计的禽流感和新城疫的血凝试验检测方法可以提升禽流感、新城疫血凝试验的诊断效率，并且成本更低、时间更短。

2 技术方案

2.1 禽流感和新城疫血凝试验检测方法步骤

（1）将禽流感血凝试验的参照血凝效价设计为9log2，将新城疫血凝试验的参照血凝效价设计为10log2。

（2）配置禽流感4HAU抗原时测参考《禽流感、新城疫4HAU抗原配制表》，血凝效价为9log2，新城疫4HAU抗原血凝效价为10log2，摇匀后开始回归检测试验，对红细胞凝集孔数量进行观察。

（3）计算禽流感血凝效价：以上一步得出的回归检测实验观察结果作为依据，在红细胞凝集孔数量大于2的X个时，此时的禽流感血凝效价为（9＋X）log2。在在红细胞凝集孔数量小于2的X个时，此时的禽流感血凝效价为（9－X）log2，X取值为0、1、2。

（4）新城疫血凝效价计算：同样结合回归检测试验结果，在红细胞凝集孔数量大于2的X个时，此时新城疫血凝效价为（10＋X）log2。在在红细胞凝集孔数量小于2的X个时，此时新城疫血凝效价为（10－X）log2，X取值为0、1、2。

2.2 回归检测试验步骤

（1）使用微量移液器在96孔V型微量反应板的1～4中加入0.025 mL PBS，形成4个平行样本并更换滴头。

（2）吸取经过均匀混合的4HAU抗原0.025 mL加入第1孔，再次摇匀。从第1孔中吸取0.025 mL滴入第2孔中，再次摇匀，从第2孔中同样吸取0.025mL加入到第3孔中，一直到第4孔放弃，并更换滴头。

（3）将体积分数1%的鸡红细胞悬液或者也可使用体积分数为0.75%的鸡醛化红细胞悬液0.025 mL加入到第1孔中。

（4）充分摇匀后，在20～25 ℃室温环境下静置20min以后进行观察，倾斜放置反应板，对红细胞凝集孔的数量进行观察并记录[2]。

3 实施方法

3.1 制备体积分数1%的鸡红细胞悬液

（1）抗凝剂使用阿氏液，选择使用大于等于3只的SPF公鸡或者是没有禽流感、新城疫抗体的鸡抗凝血液，置于离心管中，并在离心管中加入体积3-4倍的PBS充分摇匀，离心速度控制在2 000 r/min，时间持续5～10 min，离心后，血浆、白细胞层都会被去除。重复上述步骤并反复清洗血浆、白细胞层3次，再次以离心速度2 000 r/min，时间持续10 min[3]。完成后吸取压积红细胞，并使用PBS配置体积分数为1%的悬液，在恒温4 ℃的条件下保存。

（2）配置阿式液：选择2.05 g葡萄糖、0.8 g柠檬酸钠、0.055 g柠檬酸、0.42 g盐，将这些物质加入到100 mL蒸馏水中，经过散热溶解后调整至pH为6.1，在气压6KPa条件下开始高温灭菌持续15 min，完成后在恒温4℃的条件下保存备用。

3.2 配备体积分数为0.75%的鸡醛化红细胞悬液

（1）使用0.1 mol/L PBS液充分清洗新鲜红细胞5次，离心速度控制在3 000 r/min，时间持续4 min，使用压缩红细胞体积10倍的PBS液最后清洗，离心速度控制在3 000 r/min，时间持续10 min，去除上清液。

（2）以沉积红细胞8倍加入体积分数36%甲醛溶液并且于恒温4 ℃、体积分数为36%甲醛溶液充分混合均匀，恒温4 ℃条件下保持24 h，并在24 h期间需要不断振荡。

（3）取出后，以沉积红细胞1倍的体积作为标准，添加2倍体积分数为30%的甲醛溶液在恒温4℃条件下进行，保持24 h，再使用PBS溶液反复冲洗5次，制备体积分数为0.75%的醛化红细胞液，随后加入到体积分数为0.1%的叠氮钠中，在恒温4 ℃的条件下保存。

3.3 检测禽流感血凝试验的方法

（1）材料。设备：96孔V型微量反应板、带有滴头的微量移液器、一次性移液槽；溶液：体积分数为1%的鸡红细胞悬液或者是体积分数为0.75%的鸡醛化红细胞悬液；原料：禽流感病毒H7N9（RE-2株）血凝抑制试验抗原。

（2）方法。禽流感血凝试验参照血凝效价9log2；以《禽流感、新城疫4HAU抗原配制表》为参考依据，制备禽流感4HAU抗原血凝效价为9log2，充分混合均匀，对红细胞凝集孔数量进行观察：①在反应板1～4孔加入0.025mL的PBS，构成4个平行样本，完成后更换滴头；②取出0.025 mL的4HAU混匀的抗原液加入到1孔中并充分混合均匀；③从1孔取出0.025 mL的4HAU混匀的抗原液加入到2孔中，经过充分均匀混合以后同样取出0.025 mL的4HAU混匀的抗原液加入到4孔中，再从4孔中取出0.025mL的4HAU混匀的抗原液丢弃，更换滴头；④在每一个孔当中都加入体积分数为1%的鸡红细胞悬液0.025 mL；⑤充分混合均匀，在室温条件20～25 ℃环境下静置20 min观察结果。观察到的最终结果为红细胞凝集孔数量为1。

（3）计算禽流感血凝效价。根据上述步骤观察到的结果，如果在红细胞凝集孔数量与2相比小于1时，可以得出最终的禽流感血凝效价=（9-1）log2=8 log2；结果：使用检测禽流感病毒H7N9（RE-2株）血凝抑制试验抗原最终的血凝效价为8log2。

4 结论

设计一种禽流感和新城疫的血凝试验检测方法，目的是更加准确地检测禽流感、新城疫血凝试验检测，弥补现阶段使用的常规方式存在的一些不足。在试验开始之前需要明确禽流感、新城疫的血凝效价，分别确定为9log2、10log2。以《禽流感、新城疫4HAU抗原配制表》作为参照标准观察红细胞凝集孔数量。计算得到禽流感、新城疫的血凝效价以后开始回归检测，分别制备体积分数1%的鸡红细胞悬液、体积分数为0.75%的鸡醛化红细胞悬液。随后使用禽流感病毒抗原是禽流感病毒H7N9（RE-2株）血凝抑制试验抗原与禽流感4HAU抗原血凝效价为9log2，充分混合均匀后，观察实际的红细胞集孔数量。经过计算，最终得出禽流感病毒H7N9（RE-2株）血凝抑制试验抗原最终的血凝效价为8log2。