具有光协同抗菌作用纳米银复合材料的制备

刘天宇，徐 丽，钱泽丹，沈颖欣，庞千粤，卢晴风，刘 意1,*

（1.广东药科大学 药学院，广东 广州 510006；2.广东药科大学 医药化工学院，广东 中山 528458）

细菌在环境中普遍存在，目前最有效的治疗细菌感染的方法是使用抗生素；然而抗生素的使用不可避免地导致耐药菌株出现，如耐甲氧西林金黄色葡萄球菌（MRSA）和耐万古霉素金黄色葡萄球菌［1］。在过去的几十年里，抗生素耐药基因的出现［2］，导致危及生命的感染增加，已经成为严重的公共卫生负担，因此，迫切需要找到一种抗生素替代品［3］。

目前，已经报道了多种能替代抗生素的材料［如金属离子、银纳米颗粒（AgNPs）［4］、金属氧化物纳米颗粒［5］、石墨烯、纳米碳和季铵化合物［6］］，这些新材料可以降低或抑制细菌的活力。作为广谱抗菌剂［7］的AgNPs已获得美国食品药品管理局批准并广泛应用于抗菌敷料领域［8］。虽然AgNPs可以达到令人满意的抗菌效果，但一些含银敷料或软膏由于银离子的突量释放具有极高的生物毒性［9］，因此，控制银离子的释放量成了含AgNPs抗菌剂需要克服的主要问题［10］。另外，因AgNPs常规情况下呈现易于聚集的趋势，导致抗菌性能降低［11］。为解决这些问题，有必要为AgNPs找到合适的表面钝化或支持材料，在保持其抗菌活性的同时具有更好的生物相容性［12］。

光协同抗菌材料也是当前研究的一大热点，使用对可见光响应的光敏剂，可以从周围的分子氧中产生活性氧（ROS），起到抗菌的作用［13］。经典的光敏剂包括四吡咯、酞菁、吩噻嗪、亚甲基蓝等，但它们存在低水溶性、较差分散性、复杂的合成路线和低生物相容性等缺点，限制了在临床上的应用。

碳量子点（CQDs）在可见光区域内有响应，具有用作光敏剂的潜力，同时，基于CQDs的纳米复合材料在抗菌方面也具有优势。CQDs是一种新型的无金属荧光纳米粒子，具有合成简单、毒性低、生物相容性好、易于表面修饰［14］等优点，已广泛应用于成像、传感、催化等领域［15-18］。CQDs也被作为抗菌剂研究。一方面由于CQDs表面所带电荷不同，对不同种类细菌表现出不同的抗菌效果，带正电的CQDs诱导内源性ROS的能力明显高于带负电的CQDs。掺杂其他元素的CQDs对细菌具有生长抑制作用，可能是由于高正电荷破坏了细菌膜［19］；另一方面，CQDs的杀菌活性还取决于它们的表面化学基团和尺寸。本工作利用CQDs的特性，采用原位法制备AgNPs@硫氮掺杂碳量子点（S,N-CQDs）复合材料，试图实现AgNPs与S,N-CQDs良好的光协同抗菌作用，并解决传统银离子抗菌剂的生物毒性，提高生物相容性，扩大纳米银基复合材料的应用范围。

1 实验部分

1.1 主要试剂

柠檬酸（CA），β-巯基乙胺，硝酸银：均为分析纯，上海麦克林生化科技有限公司。营养琼脂，溶菌肉汤培养基（LB），沙氏葡萄糖液体培养基，马铃薯葡萄糖琼脂：广东环凯微生物科技公司。金黄色葡萄球菌，大肠杆菌，MRSA，白色念珠菌：广东文睿生物有限公司。

1.2 试样制备

1.2.1 S,N-CQDs的制备

将0.600 g CA和0.195 g β-巯基乙胺溶于10 mL纯水中，然后转移到50 mL聚四氟乙烯中，将其置于不锈钢反应器加热至150 ℃，反应3 h。反应结束后冷却至室温，形成棕黄色溶液，在透析袋（截留相对分子质量1 000）中透析24 h，每4 h换一次水，将透析液冷冻干燥得到固体，即S,N-CQDs。

1.2.2 AgNPs@S,N-CQDs的制备

称取定量S,N-CQDs溶于去离子水中，质量浓度为1 mg/mL，共100 mL；称取质量浓度为20 mg/mL的硝酸银溶液，在磁力搅拌条件下，向S,NCQDs溶液中加入5 mL硝酸银溶液。连续搅拌48 h后，得到淡黄色溶液。透析48 h除去未反应的银离子，在此期间每6 h换一次水。所得溶液经过滤、冷冻、干燥，得到淡黄色AgNPs@S,N-CQDs颗粒。

1.3 测试与表征

纳米颗粒的结构采用日本岛津制作所的UV-2600型紫外-可见分光光度计检测，200～800 nm紫外吸收光谱。傅里叶变换红外光谱（FTIR）采用日本岛津制作所的IR Affinity-1型傅里叶变换红外光谱仪测试，波数为500～4 000 cm-1。纳米颗粒形貌和粒径采用日本株式会社日立制作所的H-7650型高分辨透射电子显微镜观察。

1.4 抗菌性能测试

1.4.1 最小抑菌浓度（MIC）检测

实验前，固体培养基上的细菌，包括金黄色葡萄球菌、MRSA和大肠杆菌，在液体LB中培养24 h，白色念珠菌在沙氏葡萄糖液体培养基中培养24 h。在无菌96孔板中，每孔加入100 μL LB，在第一孔加入100 μL一定浓度的S,N-CQDs或AgNPs@S,N-CQDs复合材料，混合均匀后吸取100 μL至第二孔中，重复此步骤至最后一孔，弃去第十二号孔吸取的100 μL，各孔加入100 μL浓度为2×105CFU/mL的菌悬液。MIC通过浊度法测量，对应无浑浊孔的CQDs或AgNPs@S,N-CQDs复合材料的浓度即为MIC值。所有实验平行测三次。

1.4.2 光协同抑菌率检测

将S,N-CQDs和AgNPs@S,N-CQDs复合材料与不同种类细菌在不同浓度下共培养后，采用420 nm光源改变光照功率和光照时间，进行抑菌率测试实验。以MRSA为例进行实验：进行抑菌率平板实验前，将固体培养基上的MRSA在LB中培养24 h；然后将AgNPs@S,N-CQDs复合材料或S,NCQDs与细菌混合，使最终系统中的细菌浓度保持在1×105CFU/mL，AgNPs@S,N-CQDs复合材料或S,N-CQDs的质量浓度为0.050 mg/mL，平板涂布，利用420 nm光源采用6 W或15 W光照0，1，2，3，4 min，在37 ℃恒温孵育箱中培养24 h，统计各平板的菌落数，按式（1）计算抑菌率。然后固定15 W光照功率和3 min光照时间，改变AgNPs@S,N-CQDs或S,N-CQDs浓度，使最终系统中的细菌浓度保持在1×105CFU/mL，试样质量浓度为0.010，0.025，0.050，0.100，0.200，0.400，0.800 mg/mL，在37 ℃恒温孵育箱中培养24 h，试样组为AgNPs@S,NCQDs复合材料或S,N-CQDs，对照组为与试样组等量的LB，统计各平板菌落数，并计算抑菌率。

1.5 溶血实验

将定量2%（w）血细胞以5 000 r/min的速率离心5 min，弃去上清液，收集血细胞，加入定量灭菌磷酸缓冲盐溶液（PBS），重悬后同样条件离心，重复三次，将血细胞分散在含有AgNPs@S,N-CQDs或S,N-CQDs的PBS缓冲溶液中，最终体系中血细胞质量分数为1%，AgNPs@S,N-CQDs或S,N-CQDs浓度为0.010，0.025，0.050，0.100，0.200，0.400，0.800 mg/mL，阴性对照组为同体积PBS缓冲溶液，阳性对照组为同体积的高浓度AgNPs@S,N-CQDs水溶液，在37 ℃恒温水浴锅孵育2 h。最后，将血细胞在5 000 r/min离心5 min，测定上层清液在波长540 nm处的吸光度，按式（2）计算溶血率。

式中：OD540（试样）为试样在540 nm处的吸光度；OD540（阴性对照）为阴性对照组在540 nm处的吸光度；OD540（阳性对照）为阳性对照组在540 nm处的吸光度。

2 结果与讨论

2.1 AgNPs@S,N-CQDs复合材料的表征

从图1可以看出：S,N-CQDs在230～250 nm及350 nm处有紫外特征吸收肩峰，归因于C=O的n-π*跃迁，AgNPs@S,N-CQDs在400 nm处存在紫外吸收峰，当AgNPs存在时会在400 nm左右产生紫外特征吸收峰，说明AgNPs@S,N-CQDs已成功合成。从图1还可以看出：3 000～3 500 cm-1的宽吸收带是由于O—H和N—H的拉伸振动，表明S,NCQDs表面有许多氨基和羟基，说明S,N-CQDs和AgNPs@S,N-CQDs具有良好的亲水性；而2 600 cm-1处的吸收峰归因于巯基，1 726 cm-1处的吸收峰归因于C=O的拉伸振动，说明AgNPs与S,NCQDs中含氧官能团（即—COOH）存在相互作用，是通过形成化学键或静电吸引来实现的，1 380 cm-1处的吸收峰归因于S=O的拉伸振动，AgNPs@S,N-CQDs在此处的峰变尖锐，说明S=O的断裂，结合1 654 cm-1处出现的峰，说明AgNPs负载在S,N-CQDs上。

图1 S,N-CQDs和AgNPs@S,N-CQDs的紫外吸收光谱和FTIRFig.1 UV absorption spectra and FTIR spectra of S,N-CQDs and AgNPs@S,N-CQDs

2.2 高分辨透射电子显微镜（HRTEM）观察

从图2可以看出：AgNPs被包裹在S,N-CQDs之间，分散性良好，颗粒呈类球形，粒径均一，平均粒径为5 nm；0.238 nm晶格间距是Ag的（111）特征晶格间距，表明成功合成了AgNPs@S,NCQDs复合材料。

图2 AgNPs@S,N-CQDs复合材料的HRTEM照片Fig.2 HRTEM image of AgNPs@S,N-CQDs

2.3 抗菌性能

从表1可以看出：S,N-CQDs同样具有广谱抗菌性能，对革兰氏阳性菌（金黄色葡萄球菌）、阴性菌（大肠杆菌）、耐药菌（MRSA）、真菌（白色念珠菌）的代表性菌种都能起到抗菌作用；与S,NCQDs相比，由于引入AgNPs@S,N-CQDs的MIC值较低，说明AgNPs@S,N-CQDs的抗菌性能明显强于S,N-CQDs，表明AgNPs@S,N-CQDs在抗菌性能方面优势明显。

表1 AgNPs@S,N-CQDs及S,N-CQDs针对不同种细菌的MIC值Tab.1 MIC values of AgNPs@S,N-CQDs and S,N-CQDs against different kinds of bacteria mg/mL

2.4 光协同抑菌

从图3可以看出：光照条件下，对照组抑菌率随着光照时间或光照功率的增加而增大，单独光照情况下同样可以产生一定程度的抑菌作用。与对照组相比，由于S,N-CQDs本身具有抗菌性能，故在光照时其抑菌率较高；AgNPs@S,N-CQDs在光照时表现出较对照组和S,N-CQDs更好的抗菌性能，随着光照时间和光照功率的增加，抗菌效果也越来越明显。

图3 不同光照功率和时间下S,N-CQDs与AgNPs@S,N-CQDs对MRSA的抑菌率Fig.3 Inhibition rate of AgNPs@S,N-CQDs against MRSA under different light time and different light intensity

从图4可以看出：在15 W光照功率和3 min光照时间条件下，通过计算抑菌率已接近80%，表现出优异的光协同抗菌作用。在固定光照时间和光照功率条件下，改变AgNPs@S,N-CQDs或S,NCQDs浓度，抑菌率也随之改变。从图5可以看出：在0.050 mg/mL AgNPs@S,N-CQDs存在条件下，光照功率和光照时间固定时，抑菌率已接近80%，菌落数明显减少，能有效抑制MRSA的生长，说明在该光源激发情况下，AgNPs@S,N-CQDs有较强的光协同抗菌作用。

图4 不同浓度AgNPs@S,N-CQDs条件下采用15 W光照3 min平板实验图片Fig.4 Plate pictures about different concentrations of AgNPs@S,N-CQDs with 15 W light for 3 min

图5 不同浓度AgNPs@S,N-CQDs条件下采用15 W光照3 min的抑菌率Fig.5 Inhibition rate of different concentrations of AgNPs@S,N-CQDs with 15 W light for 3 min

2.5 溶血实验

将血细胞与不同浓度的AgNPs@S,N-CQDs或S,N-CQDs培养2 h后，从图6和图7可以看出：阳性对照组呈现明显的溶血现象。当AgNPs@S,NCQDs质量浓度低于0.200 mg/mL时，溶血率低于5%，即便当AgNPs@S,N-CQDs质量浓度为0.400 mg/mL时，也无诱导溶血现象，因此AgNPs@S,NCQDs的生物相容性良好。

图6 不同浓度AgNPs@S,N-CQDs的溶血图像Fig.6 Hemolysis images of AgNPs@S,N-CQDs on red blood cell with different concentrations

图7 不同浓度AgNPs@S,N-CQDs的溶血率Fig.7 Hemolysis ratio of AgNPs@S,N-CQDs on red blood cell with different concentrations

3 结论

a）采用原位法制备了AgNPs@S,N-CQDs复合材料，复合材料中AgNPs呈类球形，分散均匀，平均粒径5 nm。

b）AgNPs@S,N-CQDs复合材料具有良好的抗菌性能及广谱抗菌特性，在光照刺激下具有光协同抗菌作用。当复合材料质量浓度为0.050 mg/mL，波长为420 nm，光照功率为15 W，光照时间为3 min时，对MRSA的抑菌率可达80%，能有效抑制MRSA的生长。

c）当AgNPs@S,N-CQDs复合材料质量浓度为0.400 mg/mL时，也几乎不会诱导溶血，说明其具有良好的生物相容性。