miR-26b-5p通过下调MKNK2/eIF4E信号通路抑制胰腺癌细胞的增殖及侵袭

王跃华，曾丽平，曾久平，王晓红，朱志斌，赵 昕，金中奎

胰腺癌（pancreatic cancer，PC）是恶性程度最高的肿瘤之一，5年生存率不到8%[1]。目前根治性手术切除仍是治愈胰腺癌、使患者达到长期生存的有效手段；然而由于胰腺癌侵袭、转移性强，约60%的患者确诊时已处于疾病进展期，失去了手术机会。因此，探索胰腺癌发生进展相关的关键分子，对于PC的早期诊断和治疗有重要意义。microRNAs是一种非编码小分子RNA，其通过碱基互补配对原则结合在目标mRNA的3’非编码区，并使之降解，从而调控其功能。研究显示在胰腺癌进展过程中，miRNAs发挥重要的调节作用。已有报道miR-21[2]和miR-203[3]在胰腺癌组织中高表达，高表达与患者预后不良有关；miR-145[4]和miR-122-5p[5]分别靶向转化生长因子-β（TGF-β）和细胞周期蛋白G1（CCNG1），抑制胰腺癌细胞迁移、侵袭和上皮间质转化。此外，其他非编码RNA，如长链非编码RNA和环状RNA也可通过吸附作用影响miRNAs的功能。在胰腺癌中，circular RNA ADAM9可吸附结合miR-217，从而增强PRSS3基因的功能，激活ERK/VEGF信号通路[6]。长链非编码RNA HCP5可结合miR-214-3p，减少其对HDGF基因的抑制作用，从而导致胰腺癌对吉西他滨耐药[7]。本课题组在前期研究中系统分析了胰腺癌miRNA的差异表达及其与生存的关系[3]。本研究将进一步探讨miR-26b-5p的生物学功能，验证其调控的信号通路。

1 资料与方法

1.1 胰腺癌临床资料 从基因表达综合数据库（Gene Expression Omnibus，GEO ；https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo）下载数据集GSE71533和GSE85589。GSE71533包含18例正常组织和8例PC组织的miRNAs表达谱数据；GSE85589包含88例正常和19例PC患者血浆miRNA的表达数据。从癌症基因组图谱数据库（The Cancer Genome Atlas，TCGA；https://cancergenome.nih.gov）提取胰腺癌数据集，其中包含184例组织样本miRNA的表达谱和其中的174例PC患者的随访生存资料。

1.2 差异分析和生存分析 分别将GSE71533和GSE85589数据集中的样本分为PC组和正常组。通过方差分析计算miR-26b-5p表达值在两组中的差异。在TCGA-胰腺癌（TCGA-PAAD）队列中，排除术后3个月内死亡的患者，以减少手术对生存期的影响，最终纳入168例PC患者进行生存分析。按照miR-26b-5p的中位表达值，将患者分为高表达组和低表达组，通过Log-rank检验评估高、低表达组的生存曲线是否存在差异，并绘制Kaplan-Meier生存曲线表示总生存率。

1.3 miR-26b-5p的功能和通路富集分析 首先通过TargetScan数据库筛选3’非编码区与miR-26b-5p互补配对的基因集作为预测的靶基因；其次，使用R软件“clusterprofiler”程序包对miR-26b-5p靶基因进行基因本体（Gene Ontology，GO）富集分析，其中包括三方面功能注释：生物过程（biological process，BP）、细胞成分（cellular component，CC）和分子功能（molecular function，MF）；最后利用京都基因与基因组百科全书数据库（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，KEGG；https://www.kegg.jp），完成基因集的通路富集分析。

1.4 细胞培养及转染 胰腺癌PANC-1细胞购自中国医学科学院基础医学研究所细胞资源中心，用含10%胎牛血清的DMEM培养液（北京TransGen Biotech公司）体外培养至对数生长期，用胰酶消化后制成单细胞悬液。miR-26b-5p对照（NC）、类似物（mimics）和抑制物（inhibitor）购自广州RiboBio公司。短发卡干扰RNA（sh-RNA）质粒和MKNK2-pcDNA3.1质粒购自苏州GenePharma公司，并包装成GV248慢病毒。将5×105个对数生长期的PANC-1细胞接种于6孔板，参照说明书，使用Lipofectamine 3000 （Invitrogen）转染细胞。

1.5 细胞功能实验 将PANC-1细胞分为对照组、miR-26b-5p mimics组和 miR-266-5p inhibitor组，观察miR-26b-5p对细胞功能的影响。PANC-1细胞转染24 h后，接种于96孔板，每孔3×103个细胞，在37 ℃完全培养基培养0、24、48、72和96 h后，用CCK-8试剂盒在450 nm波长处测量光密度，计算细胞增殖率，每孔重复3次。

细胞迁移和侵袭实验：于Transwell下室（美国Corning公司）加入100 µL高糖DMEM培养液，转染24 h后，5×104个细胞加入上室，孵育24 h后，用4%甲醛固定15 min，用0.1%的苏木精染色15 min，用200倍光学倒置显微镜拍照，观察侵袭到膜下的细胞数，取每张膜中央部分和周围部分共计5个视野，计算细胞数。侵袭实验采用Matigal胶（美国BD公司）均匀平铺于小室的聚碳酸酯膜上，于37 ℃作用2 h备用。

细胞划痕实验：转染24 h后，将5×107个细胞接种于12孔板，孵育24 h后，用200 µL移液枪头划痕，用PBS冲洗2次，分别于0 h和24 h用倒置显微镜拍照，测量划痕宽度，计算每组0 h的平均宽度作为参照值，相对宽度=实际宽度/参照值，每组重复3次。

1.6 蛋 白 印 迹 实 验（Western blotting） 将PANC-1细胞分为对照组、miR-26b-5p mimics组和miR-266-5p inhibitor组，观察miR-26b-5p对MAPK互作丝氨酸/苏氨酸激酶2（MKNK2）蛋白表达的影响。将PANC-1细胞分为MKNK2敲减（KD）组、KD对照组、MKNK2过表达（OE）组和OE对照组，观察MKNK2对eIF4E蛋白表达的影响。MKNK2、真核细胞启动因子4E（eIF4E）和GAPDH抗体购自上海Abcam公司。将5×105个对数生长期的PANC-1细胞接种于6孔板，细胞贴壁后，弃去培养液。转染24 h后，孵育24 h，收集细胞，用RIPA裂解液处理细胞，利用BCA蛋白检测试剂盒（Beyotime）检测蛋白总量。经SDS-PAGE电泳，转膜后，室温封闭2 h。用TBST洗膜3次后，加入一抗，4 ℃孵育过夜；再次洗膜后，室温加入二抗孵育2 h；洗膜后，经ECL孵育后，在暗室扫膜显影。

1.7 统计学处理 采用GraphPad Prism 8.0软件绘图和统计分析，计量资料以表示，组间比较采用方差分析，P < 0.05为差异统计学意义。

2 结果

2.1 miR-26b-5p在胰腺癌组织低表达且与PC患者预后不良有关 在GSE71533数据集中，miR-26b-5p在PC组织中的表达值明显低于正常组织（9.65±0.10 vs 10.18±0.07，P < 0.001；图 1A）。GSE85589数据集的结果显示：miR-26b-5p在PC患者血浆的表达值明显低于正常对照血浆的表达值（0.67±0.18 vs 0.79±0.24，P=0.017；图 1B）。TCGA-PAAD生存分析显示，miR-26b-5p高表达组的总体生存率明显高于低表达组（图1C）。

图1 miR-26b-5p在胰腺癌组织中的表达及其与PC患者预后的关系

2.2 miR-26b-5p的靶基因与MAPK信号通路有关 通过TargetScan数据库，筛选出251个基因的3’非编码区有miR-26b-5p的结合位点，将这些基因作为miR-26b-5p的预测靶基因进行GO分析。结果显示：在生物学过程方面，基因主要富集在细胞酰胺代谢过程和翻译调控（图2A）；在细胞成分方面，富集在细胞质核糖核蛋白颗粒（图2B）；在分子功能方面，富集在磷脂水解酶活性方面（图2C）。KEGG通路富集分析结果显示：MAPK信号通路是富集最为明显的信号通路（P=0.002；图2D）；在miR-26b-5p的251个靶基因中，有10个基因（MKNK2、ATF2、RAP1A、HGF、CACNA2D1、TAB2、RPS6KA2、MRAS、MEF2C、IGF1）参与MAPK信号通路。由于MKNK2是MAPK信号通路的关键激酶之一，可以结合eIF4E从而激活mRNA翻译、癌性转化和肿瘤细胞的增殖，本研究选择MKNK2作为miR-26b-5p的靶基因进行后续的Western blotting验证。

图2 miR-26b-5p靶基因的GO和KEGG富集分析

2.3 miR-26b-5p抑制胰腺癌PANC-1细胞增殖、迁移和侵袭 CCK-8实验结果显示，miR-26b-5p mimics组的PANC-1细胞存活率明显低于对照组；而miR-26b-5p inhibitor组的PANC-1细胞存活率明显高于对照组（图3A）。Transwell迁移实验结果显示：miR-26b-5p mimics组迁移至下室的细胞数明显少于对照组；而miR-26b-5p inhibitor组迁移至下室的细胞数明显多于对照组（图3B）。Transwell侵袭实验提示，在miR-26b-5p mimics组穿过基质胶的细胞数明显少于对照组；而在miR-26b-5p inhibitor组，穿至下室的细胞数明显多于对照组（图3B）。划痕实验显示：miR-26b-5p inhibitor组的划痕宽度明显小于对照组；而miR-26b-5p mimics组的宽度明显大于对照组（图3C）。细胞功能实验提示，miR-26b-5p抑制PANC-1细胞的增殖、迁移和侵袭。

图3 miR-26b-5p对PANC-1细胞增殖、迁移和侵袭的影响

2.4 miR-26b-5p抑制MKNK2/eIF4E信号通路 Western blotting实验显示，与对照组相比，miR-26b-5p mimics组的MKNK2和eIF4E表达下降；而miR-26b-5p inhibitor组的MKNK2和eIF4E表达上调（图4A）。在MKNK2过表达组的eIF4E表达升高；MKNK2低表达组的eIF4E表达下降（图4B）。Western blotting实验结果显示：miR-26b-5p抑制MKNK2及其下游eIF4E蛋白的表达。

图4 miR-26b-5p对MKNK2/eIF4E信号通路的影响

3 讨论

胰腺癌是预后最差的恶性肿瘤，虽然近年来手术技术、诊断方法和治疗手段有所进步，但患者的长期生存率仍无明显改善。因此需要探索、验证影响PC进展的新机制和靶点。大量研究证实miRNAs在胰腺癌组织异常表达，可作为PC诊断和预后评估的分子标志物；miRNAs对胰腺癌的发生、进展起重要的调控作用。GEO数据库提供了胰腺癌多组学芯片数据，可以对miRNA的表达数据进行联合分析，从而筛选出更可靠的目标分子。TCGA数据库除了提供胰腺癌多组学数据外，还包含临床随访数据，因此可以探索分子表达水平与患者生存的相关性。本研究通过上述公共数据库发现，miR-26b-5p在胰腺癌组织和PC患者血浆低表达，并且miR-26b-5p高表达组PC患者的预后优于低表达组。进一步分析发现：miR-26b-5p的靶基因主要富集在MAPK通路，细胞功能实验证实miR-26b-5p抑制PANC-1细胞的增殖、迁移和侵袭。Western blotting实验也证实miR-26b-5p可抑制MKNK2/eIF4E信号通路。

miR-26b-5p在多种肿瘤中均发挥抑癌作用。例如，COL12A1在胰腺癌组织明显高表达，与PC患者预后不良有关；miR-26b-5p的表达与COL12A1负相关并有结合位点，NAMPTP1与miR-26b-5p有结合位点并且二者的表达值呈负相关，提示NAMPTP1吸附miR-26b-5p从而减弱其对COL12A1的抑制作用[8]。另一项研究显示miR-26b-5p是影响PC患者预后的保护性因素（危险比=0.53），与Cox-2信号通路有关[9]。在前列腺癌组织中miR-26b-5p低表达，可作为诊断前列腺癌的分子标志物[10]。lncRNA DUXAP8结合miR-26b-5p从而下调其功能，导致肺癌进展[11]。此外，miR-26b-5p靶向 KPNA2，抑制Burkitt淋巴瘤细胞增殖[12]。本研究通过公共数据集和细胞实验证实miR-26b-5p对胰腺癌具有抑癌作用。

基因本体分析发现：miR-26b-5p的靶基因在生物学功能方面与酰胺代谢有关。肿瘤细胞的增殖速度快，为了获得能量，谷氨酰胺的转运和代谢较正常细胞明显加快，其代谢产物也参与肿瘤细胞的生物学功能。在细胞成分方面，靶基因与核糖核蛋白颗粒有关。核糖体蛋白与细胞周期、细胞分裂、细胞凋亡、DNA损伤修复有关，可在多种肿瘤组织中过表达从而促进肿瘤细胞增殖、转移。在分子功能方面，靶基因与磷脂水解酶活性有关。近来研究发现磷脂酶A2的亚型在多种肿瘤异常表达，与肿瘤增殖、凋亡和侵袭有关。GO分析提示，miR-26b-5p可能通过调控靶基因，在多个肿瘤相关生物学功能方面发挥作用。KEGG通路分析发现：在预测的251个miR-26b-5p的靶基因中，8个基因参与MAPK信号通路。MAPK是丝裂原活化蛋白激酶，将细胞表面的信号传递到细胞核，可受到肿瘤微环境中细胞因子、激素、神经递质及细胞应激调控。MAPK通路的基本组成为三级激酶模式，包含MAPK激酶激酶（MKKK）、MAPK激酶和MAPK。这三种激酶能依次激活，共同调节细胞生长和分化，参与肿瘤的发生和进展。例如，p38 MAPK信号通路的激活可促进VEGF表达，促进胰腺癌血管生成[13]；在肝癌细胞，EGFR-p38 MAPK的激活可下调miR-675-5p从而增加PD-L1的稳定性[14]；剪接因子SF3b6可通过MAPK信号通路促进胃癌细胞的增殖和侵袭[15]。因此本研究选择MAPK通路的基因作为目标分子进行后续的实验验证。

MKNK2是蛋白激酶超家族成员，是分裂素激活蛋白（MAP）激酶激活的一种下游激酶，能够使eIF4E磷酸化，从而对于mRNA的翻译、致癌性转化和癌细胞增殖有重要作用[16]。在恩杂鲁胺耐药的前列腺癌细胞中，miR-361-3p可靶向MKNK2 3’非编码区，抑制其表达从而提高肿瘤细胞对恩杂鲁胺的敏感性[17]。在前列腺癌细胞中，mTORC1可磷酸化MKNK2从而促进eIF4E的磷酸化，促进癌细胞增殖[18]。目前发现eIF4E是MKNK2下游分子，促进胰腺癌发生和进展。例如，PHGDH与eIF4E互相作用，促进其表达从而促进胰腺癌PANC-1细胞的增殖、侵袭[19]。MKNK2/eIF4E通路的激活可以上调放疗后Sox2介导的胰腺癌细胞的增殖，提示对Sox2的干预治疗可能提高胰腺癌放疗的效果[20]。本研究在PANC-1细胞中证实miR-26b-5p可下调MKNK2/eIF4E信号通路的表达。

综上所述，miR-26b-5p在胰腺癌组织和血浆中低表达，miR-26b-5p的低表达与PC患者的预后不良有关，有可能作为胰腺癌诊断和预后评价的新型分子标志物。在机制上，miR-26b-5p下调MKNK2/eIF4E信号通路，抑制PANC-1细胞增殖、侵袭，有可能作为胰腺癌治疗的新靶点。