几种去蜡壳方法对提取红蜡蚧基因组DNA的影响

路广亮 罗卿权 孙雪婷 高磊 李跃忠

(上海市园林科学规划研究院国家林业和草原局城市困难立地生态园林重点实验室/上海城市困难立地绿化工程技术研究中心，上海 200232)

红蜡蚧（Ceroplastes rubens Maskell）属于蚧科（Coccidae）蜡蚧亚科（Ceroplastinae）蜡蚧属（Ceroplastes Gray）昆虫，一年发生一代，是园林、果树、林木植物上的重要害虫，红蜡蚧以刺吸植物汁液进行为害，发生严重时极易引发煤污病，从而影响植株长势、果树产量和林木的观赏功能[1]，寄主达104种（1986年中华人民共和国住房和城乡建设部《中国园林植物病虫害和天敌资源普查及检疫对象研究》课题结题材料记录）。红蜡蚧具有固定取食的特性，初孵若虫固定后即开始分泌蜡质分泌物，然后虫体逐渐被厚厚的蜡壳紧密包裹，且很难将虫体和蜡壳进行分离。

红蜡蚧的蜡壳很难剥离，这给红蜡蚧的观察和研究造成了一定影响，特别是在提取红蜡蚧基因组DNA时，在研磨破碎虫体过程中，大量蜡质黏附于研棒和容器壁上，很难剥离。笔者通过查阅有关文献发现，有的研究者在制作蜡蚧玻片标本前，用氯仿或正己烷浸泡去除蜡壳[2-3]，有的研究者采用白炽台灯烘烤软化后用解剖针轻轻拨去蜡质[4]，有的研究者采用20%氢氧化钠煮的方法去除蜡壳[5]，有的研究者在显微镜下用解剖针和镊子将蜡壳去除[6]。但在文献查阅中，笔者尚未发现快速有效去除蜡蚧表面蜡壳的方法，也尚无蜡壳对提取蜡蚧基因组DNA影响的相关研究报告。在此背景下，笔者特进行了几种去蜡壳方法对提取红蜡蚧基因组DNA的影响试验，以期探明不同去蜡壳方法对红蜡蚧基因组DNA提取质量的影响，从而筛选出快速有效去除红蜡蚧虫体表面蜡壳的方法。现将相关试验结果报道如下。

1 材料与方法

1.1 红蜡蚧来源

红蜡蚧于2021年11月9日采自上海市浦东新区金海路街头绿化带内的火棘，即剪取受红蜡蚧为害的火棘枝条，带回实验室，室温下保存，11月15日用镊子将红蜡蚧从火棘枝条上慢慢剥下，目测挑选外形完整、大小类似、蜡色正常的红蜡蚧作试验材料。

1.2 试验设计

试验依据去蜡壳方法不同，设处理：（1）去蜡壳方法1（开水法）。将供试红蜡蚧放入有刻度的50mL离心管里，注入100 ℃沸水30 mL，在Vortex-Genie 2振荡器（Scientific Industries，美国）上涡旋振荡2 min，用无污染挑针将已溶解掉蜡壳的虫体挑到1.5 mL离心管里。（2）去蜡壳方法2（吸水纸法）。在低倍解剖镜下，将红蜡蚧腹部向上，先用灭菌挑针刺破红蜡蚧，挤出体液，用吸水纸吸收，再用挑针尽量刮取红蜡蚧体内破碎的组织残体，也用吸水纸吸取，将吸有红蜡蚧体液和组织残体的吸水纸放到1.5 mL离心管里。（3）去蜡壳方法3（石蜡油法）。将红蜡蚧放入2 mL离心管里，加入石蜡油浸泡，50 ℃水浴30 min后，用灭菌挑针将红蜡蚧虫体转移到1.5 mL离心管里。（4）去蜡壳方法4（正己烷法）。将红蜡蚧放入2 mL离心管里，加入正己烷浸泡46 h，将浸泡过的红蜡蚧倒在吸水纸上，在低倍解剖镜下，用无菌挑针轻轻剥去蜡壳，将剥去蜡壳的虫体转移到1.5 mL离心管里。（5）去蜡壳方法5（冰冻法）。将红蜡蚧连同枝条一起放在-20 ℃的冰箱里冰冻46 h，取出后立即用挑针剥去蜡壳，将剥去蜡壳的虫体转移到1.5 mL离心管里。（6）不去除蜡壳对照（CK），直接连同蜡壳将虫体一起放入1.5 mL离心管里。每处理重复3次，每重复5头红蜡蚧。

1.3 红蜡蚧基因组DNA的提取

将各处理离心管里的红蜡蚧虫体，分别用研棒尽可能研碎。使用DNeasy Blood Tissue Kit（Qiagen，德国）提取试剂盒，按照说明书提取红蜡蚧基因组DNA，最后加入125 μL Buffer AE洗脱液二次洗脱DNA，室温下静置 1 min后，以8 000转/min的转速离心1 min收集DNA溶液。提取的DNA溶液于-20 ℃冰箱内保存备用。

1.4 基因组DNA质量检测和扩增测序

1.4.1 红蜡蚧基因组DNA的浓度与纯度检测

使用NanoDrop 2000超微量分光光度计,测定基因组DNA的浓度及紫外吸收峰值A260/A280值。每样品溶液测3次，取平均值。

1.4.2 红蜡蚧基因组DNA的PCR扩增检验及测序

取等量DNA样品溶液作为模板，采用昆虫线粒体COI基因通用引物对(由上海派森诺生物科技有限公司合成，上游引物L C O-1 4 9 0，5’-G G T C A A C A A A T C A T A A A G A T A T T G G-3’；下游引物H C O -2 1 9 8 ，5 ’-T A A A C T T C A G G G T G A C C A A A A A A T C A-3 ’)，采用25 μL PCR 反应体系（其中，Mix为12.5 μL，引物LCO-1490为1 μL，引物HCO-2198为1 μL，模板 DNA 为 1.5 μL，ddH2O 为 9 μL，见表1），使用SimpliAmp Thermal Cycler PCR仪（Thermo Fisher Scientific，美国），扩增红蜡蚧基因组DNA的COI基因片段。

表1 PCR反应体系

反应程序：94 ℃预变性4 min；94 ℃变性30 s，47 ℃退火45 s，72 ℃延伸45 s，32个循环；72℃终延伸20 min；PCR产物置于4 ℃保存待用。

以3 μL 的2 kb Ladder（DL2000 TM DNA Marker; Takara) 作为标准，将3 μL PCR 产物在1%琼脂糖凝胶（电极缓冲液1×TAE）上进行电泳检测，并切胶回收目标条带，纯化后送上海派森诺生物科技股份有限公司测序。

2 结果与分析

2.1 红蜡蚧基因组DNA的浓度与纯度

由图1可知，6个处理的红蜡蚧基因组DNA的浓度均能满足后续一般分子生物学实验的DNA浓度要求。除去蜡壳方法2（吸水纸法）处理外，其他处理都能提取出较高浓度的DNA，且各处理间红蜡蚧基因组DNA的浓度差异不大。去蜡壳方法2处理的红蜡蚧基因组DNA浓度较低，其原因可能是吸水纸仅吸取了部分体液和混杂在体液中的虫体破碎组织，损失了较多虫体组织。在GraphPad Prism 9中，对各样品溶液的D N A浓度进行O n e-w a y ANOVA(uncorrected Fisher’s LSD test)统计分析，结果表明，不去除蜡壳对照、去蜡壳方法1处理、去蜡壳方法3处理、去蜡壳方法5处理的红蜡蚧基因组DNA浓度相当，处理间差异不显著；去蜡壳方法4处理的红蜡蚧基因组DNA浓度显著高于不去除蜡壳对照；去蜡壳方法2处理的红蜡蚧基因组DNA浓度显著低于不去除蜡壳对照。

图1 不同去蜡壳方法的红蜡蚧基因组DNA浓度比较

A260/A280值常被用作核酸DNA纯度的指示值[7-10]，是DNA质量分析的指标之一。一般来讲，DNA样品溶液的A260/A280值介于1.8～2.0之间时，表示提取的DNA纯度较好；DNA样品溶液的A260/A280值低于1.8时，表示提取的DNA中存在蛋白质或者酚类物质。由图2可知，6个处理的DNA样品溶液的A260/A280值均超过1.8，且大部分介于1.8～2.0之间。以上结果表明，6个处理提取的红蜡蚧基因组DNA纯度均较好，均可满足后续一般分子生物学实验的DNA纯度要求。

图2 不同去蜡壳方法的DNA样品溶液的A260/A280值

2.2 基因组DNA的PCR扩增检验及测序

由图3可知，以各处理提取的红蜡蚧基因组DNA为模板进行PCR扩增，均可获得大小约为700 bp的扩增产物，与预期的COI片段大小相当，再将各处理测得的序列使用NCBI进行blast比对，各处理测得的序列都与红蜡蚧COI序列一致。以上结果表明，各处理提取的红蜡蚧基因组DNA的COI基因片段均得到成功扩增，提取的基因组DNA确实是红蜡蚧的遗传物质，不同去蜡壳方法或不去除蜡壳均不影响基因组DNA的提取，且均未对红蜡蚧基因组DNA造成污染，提取的红蜡蚧基因组DNA均能满足后续一般分子生物学实验的需求。

图3 不同去蜡壳方法的红蜡蚧基因组DNA的PCR扩增COI产物凝胶电泳图

3 结论和讨论

本试验结果表明，可用带蜡壳的虫体作为试验材料直接提取红蜡蚧的基因组DNA，蜡壳的存在与否，对提取的红蜡蚧基因组DNA的浓度与纯度没有影响；同时，通过基因组DNA的PCR扩增检验及测序，进一步证明了蜡壳对红蜡蚧基因组DNA提取及下游PCR扩增没有影响。

值得注意的是，笔者在试验中发现，若是虫体连带蜡壳一起采用DNeasy Blood Tissue Kit 提取试剂盒提取基因组DNA，在第1次离心时，吸附柱中约有30%的液体会留存，需要进行2次离心才能全部离心到收集管中，但这并不影响最终的DNA提取质量。同时，本试验仅采用了DNeasy Blood Tissue Kit 提取试剂盒提取红蜡蚧基因组DNA，而基因组DNA的提取方法有很多，蜡壳的存在是否影响其他提取方法的DNA提取结果尚无试验数据支持，这仍有待进一步验证。此外，蜡蚧科蜡蚧属蚧壳虫约有147种[11]，蜡蚧虫体表面有蜡壳是其重要特征，且不同蜡蚧的蜡质分泌物在结构和化学成分上有所差异[12]，本试验证明红蜡蚧的蜡壳对基因组DNA的提取质量没有影响，而其他蜡蚧的蜡壳是否对基因组DNA的提取质量没有影响目前仍不明确，故在相关属种介壳虫基因组DNA提取技术上或许有进一步优化的空间。

虽然本研究表明蜡壳的存在与否对红蜡蚧基因组DNA的提取质量没有影响，但是研究筛选出既快速便捷、又操作性强的蜡壳去除技术仍有其必要性，例如，可以提高离心效率，缩短红蜡蚧基因组DNA提取时间，便于对红蜡蚧虫体外观特征进行直接观察，从而补充完善外观描述的准确性等。然而，红蜡蚧去除蜡壳是一项难度很高的操作，且本试验选用的去蜡壳方法都存在一定的缺陷。例如，用开水法去蜡，虫体很容易因水温下降蜡质再次凝固，从而将虫体黏附于试管壁上；采用吸水纸法去蜡，提取的DNA浓度较低，有较多损失，且不能获得完整的虫体；用石蜡油法去蜡需要水浴，且不能将蜡壳完全去除；用正己烷法去蜡，要正确掌握浸泡时长，一般以浸泡时长介于24～72 h较为合适（少于24 h，蜡壳没有充分松软；大于72 h，蜡壳太软逐渐呈胶糊状、黏度较大，蜡壳和虫体不易分离，而且黏连挑针，去除蜡壳的难度大幅增加），浸泡后，蜡壳的红色表面变为灰色，蜡壳松软合适，解剖镜下用挑针轻轻一挑，蜡壳即分成几块，便于将蜡壳从虫体上轻轻挑离，露出金黄色、饱满、完整的半球形虫体，但是正己烷极易挥发，长时间操作会影响操作人员的健康；采用冰冻法去蜡，虽然可以较容易去除蜡壳（用挑针轻刺蜡壳，冰冻硬化的蜡壳即会破裂，便于用挑针将蜡壳从虫体上小心挑离），但是在室温下，蜡壳会很快解冻回软而黏连，故采用该方法去除蜡壳需要操作迅速，或放在冰盒上进行操作。综合考虑，去除红蜡蚧蜡壳较为方便、快捷且剥离效果好的方法为正己烷法，且笔者发现，以纯酒精取代正己烷去除蜡壳的效果更好。