睾丸间质细胞传代、冻存、复苏初步研究

文│吕双阳（山东省海阳市二十里店镇畜牧兽医站）

随着对细胞的不断传代，优势细胞逐渐生长，传代培养的细胞梭形占比逐渐加大，而生长速度慢或是生长活力低的细胞会被逐渐淘汰。细胞冻存复苏后的状态与冻存保护剂种类、冻存时间、冻存方式、细胞复苏方法等有关，也与各种生物学试验结果有关。为了更好地建立细胞库，实现其相应价值，笔者对此进行了试验探索，下面则是具体的试验过程和相关结论。

一、材料与方法

1.主要试剂。RPMI-1640培养基（GIBCO）、胎牛血清（HyClone）、Ⅱ型胶原酶（Sigma）、胰酶、台盼蓝、二甲苯。

2.试验动物。健康3周龄的荣昌公猪。为了增强试验效果的普遍适用性，本次选择过程采取随机选择的方式，尽量降低人为干扰。

3.试验方法与检测方法。试验方法及检测方法都会对最终的结果产生一定的影响，因而为了选择更佳的荣昌仔猪睾丸间质细胞传代及冻存复苏培养方法，笔者尝试进行如下方法。

（1）仔猪睾丸间质细胞的传代及冻存与复苏。睾丸间质细胞的传代培养：为了试验的精准性，在睾丸间质细胞传代培养过程中有很多注意事项，下面对此进行具体剖析。进入试验阶段的原代细胞需要经过一定的筛选和过滤，这不仅是为了试验的精准性，同时也是为了更好地普及和推广相应方法。基本原则为：细胞单层大概要长到95%左右最好，然后舍弃其中的营养液。先用新鲜培养液清洗、弃去，然后加入1～2毫升的0.25%胰酶，静置5～10分钟，弃去胰酶后加入培养液，用吸管吸取培养液，并反复吹打培养瓶瓶壁细胞，形成细胞悬液。将细胞悬液吸入10毫升离心管中，1000转/分钟离心5分钟，弃去上清液，加入适量新鲜培养液，移入新的培养瓶中，37℃，5% CO2，饱和湿度下培养。24小时后换液，以后每天换液一次。

睾丸间质细胞的冻存与复苏。细胞冻存：选用传代第一次的细胞，细胞消化同传代培养的方法，将细胞悬液收集至离心管中，1000转/分钟离心5分钟，弃去上清液，细胞沉淀中加入冻存培养液（含10%的DMSO），移入冻存管中，计数，细胞浓度为5×106/毫升左右。

采用两种方法对细胞进行冻存。

慢冻方法：将培养的细胞分为4组，然后分批次、分温度、分时间进行冷冻，具体温度和时间如下：首先将冻存管放到4℃的冰箱中，静置40分钟，然后放到-20℃的冰箱中0.5～1小时，之后将其放到-80℃的冰箱中，这种冰箱属于超低温冰箱，此时需要将冻存管进行过夜放置，最后将其放到液氮罐中保留。这种方法环节较多且操作严格，需要格外细致。

快冻方法：第一步与慢冻方法一致，也是划为4组，将冻存管（管口要朝上）放到纱布袋内，放入-80℃超低温冰箱中过夜，第二天就可以观察其变化，然后直接放入液氮罐中保存。虽然快冻方法中突出的是速度、时间问题，但其中所要注意的事项也不容忽视，尤其是纱布清洁度、温度控制及第二天的观察精细度等也都要格外注意。

细胞复苏：既然是复苏就需要有一个解冻过程，具体操作步骤如下：首先从液氮罐中提取细胞，整个过程中也应注意清洁度、缓慢度，确保提取出来的细胞生命体征及特点不受外界因素干扰。然后放到适宜的温度中进行融化，温度约为38℃，融化时间控制在1分钟左右即可，然后用培养液稀释，低速离心10分钟，弃去上清，加新鲜培养液培养刚复苏的细胞。将细胞悬液与0.4%台盼蓝染液以9∶1比例混匀，并取少量混合液渗入计数板和盖玻片的间隙中，血球计数板计数，细胞复苏率的计算公式如下：

复苏率/%＝（活细胞数/细胞总数）×100

总之，复苏过程相对复杂，涉及的环节比较多，在试验过程中要格外注意。

（2）仔猪睾丸间质细胞的鉴定。台盼蓝染色的活力测定：台盼蓝染色的活力测定需要一定的配比控制，具体将细胞悬液与0.4%台盼蓝染液按9∶1的比例混匀。取少量混合液渗入到计数板和盖玻片的间隙中，在显微镜下计数，主要观察蓝色的死细胞数量变化以及无色透明的活细胞数量变化，活细胞就代表细胞的活力，活细胞越多会导致活细胞率逐渐提升，具体计算公式如下：

活细胞率/%＝[活细胞总数/（活细胞总数＋死细胞总数）]×100

3β-HSD细胞纯度鉴定：在倒置显微镜下观察经3β-HSD染色的细胞悬液，细胞质中会出现一些蓝色颗粒状细胞，这就是常说的睾丸间质细胞。此时用阳性来代表纯度，纯度鉴定由此展开，具体计算公式如下。

阳性细胞率/%＝（3β-HSD阳性细胞数÷总细胞数）×100

二、试验结果

1.仔猪睾丸间质细胞传代及冻存与复苏。

（1）睾丸间质细胞传代生长状况。传代细胞经过1天左右的变化就可以观测到睾丸间质细胞贴壁的动态，基本是次日开始出现触角，此时随着代数的不断增多，细胞梭形也会开始产生变化，如占比逐渐提升。如图1、图2。

（2）睾丸间质细胞冻存与复苏结果。本试验中应用的冻存剂是10%二甲亚砜，其具有分子量小、溶解能力强、渗透能力强等特点，也是应用最广的冻存保护剂。试验采用两种不同的冷冻方法后发现，采用慢冻方法冷冻后细胞复苏率较高。冷冻速度对细胞内部的影响十分明显，尤其是生理变化值得探究。经过试验可以得出如下结论，冷冻速度直接会影响细胞水分及体积，具体表现特征为如果冷冻速度偏慢，细胞脱水问题比较明显，导致细胞体积缩小，一旦达到一定程度，细胞活性将会受到影响，这种影响属于溶质性损害。如果冷冻速度偏快，细胞内部的冰晶也会受到一定影响，直接影响融化速度。两种冻存方法比较发现，慢冻方法的细胞复苏率大于快冻方法的细胞复苏率，复苏率见表1。

由表1可知，冻存方法不同，细胞复苏率也呈现一定变化，虽然本次试验分为4组，但通过横向对比可以看出，不论哪组都可以很好地证明慢冻方法的细胞复苏效果更好。这也很好地诠释了冻存、复苏之间的关系。

表1 两种冻存方法的复苏率 %

三、讨论

在细胞体外培养中，为了试验实际操作，需要长期保存细胞的生物活性，细胞冻存与复苏是经常使用的试验操作。细胞冻存复苏后的状态与冻存保护剂的种类、冻存时间、冻存方式、细胞复苏方法等有关，也与各种生物学试验结果有关。

试验采用两种不同的冷冻方法，即慢冻方法和快冻方法，结果发现，慢冻方法冷冻后细胞复苏率较高。也有研究发现，两种方法之间的过渡方法冻存复苏后，细胞复苏率高于其他两种冻存方法，这可能与试验材料、试验方法有关。

因此，在细胞复苏过程中对温度控制和观察力度都要格外注意，因为温度变化会影响解冻速度，观察的敏锐性可以很好地进行调整。因此，需要思考如何在不影响细胞质量的前提下进行缓慢解冻，既可以保证细胞复苏的进程，同时又可以很好地控制细胞损伤度，虽然存在一定难度，但只要协调就可以很好地为细胞库建立和细胞活性保持提供更强的后盾。

◎图1 传代1天的睾丸间质细胞（100×）

◎图2 传代3天的睾丸间质细胞（100×）