RNAi在作物病虫害防治中的应用现状综述

谢锋华 农知旺 吴 娟 郭珍珍 竺锡武

（湖南人文科技学院农业与生物技术学院，湖南娄底 417000）

植物病虫害严重威胁作物的生长，影响作物的产量和品质。虽然喷施化学农药能有效减轻病虫害对作物的危害，但长期大量使用化学农药易使其产生抗性，也会对环境造成污染。随着生物技术的快速发展，基因改良在作物抗病虫害中的应用越来越多。RNAi具有特异性、高效性、高稳定性、可遗传性和可传递性等优点[1]，对病虫害防治具有重大意义。

1 RNAi的概念及原理

1.1 RNAi概述

RNAi即 RNA 干扰（RNA interference），是指在进化过程中高度保守的、由mRNA同源互补序列的双链RNA（dsRNA）介导的、mRNA高效特异性降解的基因沉默现象[2-3]。RNAi是近年来在基因功能研究中的重要发现，发生在除原核细胞以外的所有真核生物细胞内，具有重要的生物学功能[4-5]。RNAi发生过程主要有3个阶段：第一阶段，dsRNA被细胞内的核酸内切酶Dicer切割成21～23 bp的具有特定结构的小分子双链 RNA（small interfering RNA，siRNA）[6]；第二阶段，siRNA在解旋酶的作用下解链成正义链和反义链，再由反义siRNA在核酸内切酶、核酸外切酶及解旋酶的辅助下识别同源序列蛋白，与siRNA结合形成siRNA诱导沉默复合物（siRNA-induced interference complex，RISC），RISC 会 与 靶 mRNA 识别并将其降解[7-9]；第三阶段，siRNA反义链可以作为引物与靶mRNA结合，在依赖于RNA的RNA聚合酶（RNA-dependent RNA polymerase，RdRP）的催化下形成新的dsRNA[10]，新合成的dsRNA又可以被Dicer剪切形成大量新的siRNA，这样不断进行随机降解性聚合酶链式反应（random degradative PCR），使细胞中的siRNA分子不断增多，RNAi的作用被进一步放大，最终将靶mRNA完全降解[11-12]。

1.2 病毒诱导的基因沉默

病毒诱导的基因沉默（virus-induced gene silencing，VIGS）是以RNA干扰为基础，主要用于研究动植物基因功能的一种遗传技术。它是通过插入目的基因片段的重组病毒载体侵染植物后，沉默植物或动物的内源基因，使其功能表型出现变化，根据表型变化来研究基因功能，其属于转录后基因沉默（posttranscriptional gene silencing，PTGS）。 VIGS 是植物防御RNA病毒侵染的自然机制，可以阻止病毒在植物细胞中的增殖与扩散，在阻止病毒入侵的同时，也会抑制与植物内源基因同源片段的表达，属于一种PTGS的类RNAi现象，普遍存在于植物体中[13-15]。

1.3 寄主诱导的基因沉默

寄主诱导的基因沉默（host induced gene silencing，HIGS）是以RNA干扰为基础，对VIGS的进一步发展。在病害防治中，以病原真菌生长发育和侵染过程中的关键基因为靶基因，通过靶标基因的RNA干扰载体在寄主植物中表达，沉默病原真菌中的靶标基因，抑制病原真菌的生长与入侵，从而提高寄主植物的抗病性[16-18]。在虫害防治中，主要以害虫生长发育或重要行为过程中的关键基因为靶基因，通过靶标基因的小干扰RNA抑制目的基因的翻译或转录，沉默靶标信使RNA，使害虫的正常生长发育受到阻碍，从而提高寄主植物抗虫的能力[19-20]。

2 RNAi在植物病害防治中的应用

植物病毒种类多、危害严重，感染病毒的作物产量和品质大幅度下降。利用RNA干扰技术可以特异性降解植物中病毒的靶基因，使病毒基因沉默，从而防治植物病害。

在小麦病害防治上，杨鹏[21]以赤霉菌基因（Chs7-3，Chs7-4，Gls-6 和 Myo II-14）为靶基因，经农杆菌介导转入小麦，得到的转基因植株增强了小麦对赤霉病的抗性。Panwar等[22]等通过根癌农杆菌的介导，沉默了小麦锈菌编码的亲环蛋白（PtCYC1）、MAP激酶（PtMAPK1）、钙调磷酸酶 B（PtCNB）基因，沉默后抑制了菌丝的生长和真菌孢子的产生，明显减轻小麦锈病的发生。BSMV-HIGS体系[23]成功沉默了小麦锈菌中的多个致病基因，如分泌蛋白基因Pst8713、蛋白激酶（Ps SRPKL）[24]、MADX 转录子（PstMCM1-1）[25]、小的 GTP 结合蛋白（PsRan）等，沉默后会抑制菌丝的生长与扩散，从而减轻小麦锈病的发生。

在水稻病害防治上，许赵蒙[26]对OsSBR1过表达水稻株系和基因编辑纯合突变株系进行离体叶片接种鉴定，根据病斑面积大小，OsSBR1过表达株系表现出纹枯病感病，而基因编辑株系表现出抗病，从而验证了OsSBR1对纹枯病抗性的负调控。唐 喆等[27]利用对稻瘟病菌分生孢子萌发有重要作用的RHO1基因为靶基因构建RNAi干扰载体，将其导入日本晴水稻品种中，得到了抗稻瘟病菌的转基因水稻。Zhu等[28]通过雀麦花叶病毒诱导的RNA干扰，以MoMAC1、MoABC1和MoPMK1等3个致病基因为靶基因，将其接种到水稻上，能够显著提高水稻对稻瘟病菌的抗性。赵玉丹等[29]以EIL6基因为靶标基因构建RNAi干扰载体pRTV-nHA-OsEIL6，将其导入水稻品种泰粳394中，发现该转基因水稻降低了对稻瘟病的抗性。Ahmed等[30]以水稻黑条矮缩病毒的致病关键基因P7-2和P8为靶标基因导入水稻后，发现转基因水稻对病毒有较强的抗性。

在其他作物病害防治上，Xu等[31]在棉花中表达靶向棉花黄萎病病菌G蛋白信号转导调节因子（Vd-RGS1）的RNA干扰载体，增强了棉花对黄萎病的抗性。Ghag等[32]通过内含子发夹RNA（ihpRNA）介导的真菌基因为靶基因构建小干扰RNA（ihpRNA-VEL和ihpRNA-FTF1），利用农杆菌介导转入香蕉，得到的转基因香蕉株系能够抑制枯萎菌丝的生长，从而提高了香蕉植株对枯萎病的抗性。Zhang等[33]利用参与植物细胞分化、增殖、衰老和死亡的DEKs基因为靶基因构建RNAi干扰载体，沉默后发现番茄对灰霉病菌和假单胞菌的抗病性降低。Noman[34]等利用MYB转录因子CaPHL8基因为靶基因，将其转入辣椒后发现接种青枯病病菌植株的CaPHL8表达上调，使辣椒降低了对青枯病的抗病性。

3 RNAi在害虫防治中的应用

RNAi抗虫技术利用RNAi技术沉默在害虫生长发育或重要行为过程中的关键基因，阻碍害虫正常的生长和繁殖，导致害虫死亡，从而降低害虫的危害程度。

大多数研究通过RNAi技术抑制害虫生长发育来防治害虫，孙李曈[35]以脱落酸合成的一种关键基因9-顺式-环氧类胡萝卜素双加氧酶基因（OsNCED3）为靶基因，发现过表达OsNCED3基因的水稻上褐飞虱的数量最低，且水稻植株平均受害级别显著低于对照，使稻飞虱的生长发育受阻，说明过表达OsNCED3基因的水稻对褐飞虱具有一定的抗性。将以棉铃虫几丁质酶基因（HaCHI）为靶基因的dsRNA转入烟草中，沉默了棉铃虫的几丁质酶基因，使棉铃虫幼虫发育畸形，从而抑制棉铃虫的生长[36]。梁思佳[37]以影响中黑盲蝽生殖能力的As FAR基因为靶标，将其转入棉花，当中黑盲蝽取食该转基因棉花后，发现中黑盲蝽的生长发育受到了影响，说明该转基因棉花对中黑盲蝽有较强的抗性。Gurusamy等[38]利用Cellfectin Ⅱ转染试剂构建的RNAi干扰载体，将其饲喂草地贪夜蛾幼虫，发现iap基因显著下调，导致幼虫的生长发育受到影响，从而抑制害虫草地贪夜蛾的生长。Shivakumara等[39]利用msp-18和msp-20基因为靶基因，得到表达msp-18和msp-20的转基因茄子，在转基因茄子中南方根瘤菌的增殖分别减少了43.64%～69.68%和41.74%～67.30%，在生长发育的线虫中，南方根瘤菌细胞壁修饰酶（CWMEs）与先锋基因有着相互作用，先锋基因msp-18和msp-20通过影响入侵线虫CWME基因的稳态转录水平来提高茄子的抗线虫性。

还有些研究是利用RNAi技术降低害虫对化学农药的抗性来防治害虫。常 蕾等[40]利用Q型烟粉虱的一个P450基因（CYP6CM1）和一个羧酸酯酶基因（Coe1）为靶基因构建双价RNAi载体，通过农杆菌介导转入烟草，采用转基因烟草喂养烟粉虱，发现烟粉虱CYP6CM1基因和Coe1基因的表达显著降低，从而降低了烟粉虱对有机磷类杀虫剂辛硫磷和烟碱类杀虫剂阿维·吡虫啉的抗药性，显著提高了杀虫剂的防治效果。范继巧等[41]利用苹果黄蚜的P450基因AcCYP6CY14为靶基因构建RNAi载体，沉默了苹果黄蚜的P450基因AcCYP6CY14，沉默后极显著提高了苹果黄蚜对吡虫啉的敏感性，苹果黄蚜的死亡率提高了65.2%，从而提高了杀虫剂的防治效果。

4 存在的问题及展望

RNAi技术作为新型绿色环保的病虫害防治技术，有着良好的应用前景，特别是在动植物基因功能的发掘与鉴定中发挥着重要作用。但是，RNAi技术的应用也存在一些问题。首先，RNAi能够特异性地降低或抑制靶基因表达，但靶基因的沉默效率难以控制，且建立遗传转化体系需要很长时间，增加了科研周期[42]。同时，得到的转基因植株在鉴定时会出现假阳性以及转基因植物的安全性都是无法回避的问题。其次，RNAi如何实现大田应用，在大田使用RNAi防治病虫害是否也会像化学农药一样使病虫害对其产生抗性等问题都有待深入研究[43-44]。随着科研的不断攻关，越来越多的技术将会被发掘，而用RNAi联合其他措施对病虫害进行综合防治将会成为一种趋势[45]。相信随着科学技术的不断发展，RNAi的应用前景会越来越广阔。