免疫治疗相关生物标志物在消化道肿瘤中的应用*

陈渝宏 杨彪 综述 廖正银 审校

有研究证实氟尿嘧啶类、铂类、蒽环类药物的常规化疗方案可提高消化系统肿瘤的治疗疗效，但预后仍然很差[1]。近年来，美国临床肿瘤协会（ASCO）和欧洲肿瘤协会（ESMO）会议相关报道强调了免疫检查点抑制剂在胃癌、结直肠癌和肝癌等消化道肿瘤治疗的前景[2-3]。与化疗不同，免疫治疗主要是重新激活或者动员自身免疫系统，并以其持续时间长、易感度低等特性在临床中占有更广阔的前景[4]。其中，帕博丽珠单抗和纳武单抗逐渐改变了传统化疗在晚期肝细胞肝癌、胃癌、结直肠癌中的地位[5]。

不同类型肿瘤的治疗反应存在显著性差异，即使患有同种恶性肿瘤的患者在使用抗程序性死亡受体-1 及其配体（programmed death-1/programmed deathligand 1，PD-1/PD-L1）或细胞毒性T 细胞相关蛋白-4(cytotoxic T lymphocyte associate protein-4，CTLA-4）抑制剂治疗时也可能表现出不同的治疗反应。因此，迫切需要利用生物标志物来识别和筛选患者，以实现个体化、精准化治疗。近年来，多项研究对多种可能具有潜在预测作用的生物标志物进行了探索，如PD-1、肿瘤突变负荷（tumor mutational burden，TMB）、微卫星不稳定性（microsatellite instability，MSI）和循环肿瘤DNA（circulating tumor DNA，ctDNA），但目前尚未达成共识[6-8]。

尽管这些潜在的生物标志物被广泛研究，由于检测过程差异及检验临界值尚未明确，其无法成为可靠的、可用于预测多种类型肿瘤免疫治疗疗效的生物标志物。本文将对已有的生物标志物分子进行总结，以期探索免疫治疗疗效与相关分子的预测作用，为临床治疗提供新的策略，进而为实现医学个体化、精准化治疗奠定一定的理论基础。

1 PD-L1 及其预测作用

目前，已有研究表明PD-L1 表达水平与免疫治疗疗效之间存在潜在的联系，针对PD-L1 作为一种预测性的生物标志物的相关研究已广泛开展[9]。在非小细胞肺癌和黑色素瘤中已发现PD-L1 的表达和抗PD-1/PD-L1 的治疗疗效呈正相关。但在消化系统肿瘤中是否存在类似的关系仍不清楚。PD-L1 阳性的患者可能对PD-1/PD-L1 抑制剂低反应甚至无反应，而PDL1 阴性的患者也可能从中受益。KEYNOTE 590 研究表明帕博丽珠单抗治疗PD-1 阳性食管癌患者的治疗效果明显优于PD-1 阴性的患者[10]。然而，KEYNOTE 601 研究的结果显示，帕博丽珠单抗用于治疗胃癌在生存率方面无显著性差异。即使同样采用抗PD-1 药物，在食管癌和胃癌中也可以观察到不同的缓解率。同样，KEYNOTE 602 研究发现，PD-L1 高表达和低表达的胃癌患者的治疗疗效差异无统计学意义。另外，CheckMate 040 研究表明，肝癌患者PD-L1 表达水平与肿瘤的局部控制可能无显著性相关[11]。REGONIVO 研究表明，随着PD-L1 水平的升高，结直肠癌的治疗疗效有所提高[12]。以上研究表明，PD-L1 在区分潜在有效和无效患者时缺乏准确性，PD-L1 表达不足以作为一个独立的生物标志物，但在使用抗PD-1/PD-L1 治疗时，其在患者识别与筛选中的作用不容忽视。因此，需要进一步探索PD-L1 的在消化系统肿瘤中标准化和可重复性的预测价值。

1.1 帕博丽珠单抗治疗疗效与PD-L1 表达相关性

帕博丽珠单抗是一种被广泛研究的抗PD-1 抗体，已应用于多种消化系统肿瘤，尤其是食管癌和胃癌。有关PD-L1 表达状态与免疫治疗疗效之间相关性的研究正在广泛开展，以筛选最佳适用者并从整体人群中剔除无效患者，进而最大化提高治疗效益并减少不良反应。PD-L1 表达水平经常被用来区分食管癌和胃癌的优势群体，同时，在使用免疫检查点抑制剂治疗时，PD-L1 综合阳性评分（combined positive score，CPS）越高其总生存期越长。因此，免疫抑制剂帕博丽珠单抗被美国国家综合癌症网络（NCCN）指南（2019 版）推荐用于PD-L1 阳性晚期食管癌的二线治疗。

KEYNOTE 180、KEYNOTE 181 等研究表明，在食管癌的治疗中，当帕博丽珠单抗作为二线/三线单药或者一线联合治疗时，PD-L1 的 CPS≥10 分患者可以获益。同时，KEYNOTE 059、KEYNOTE 061 等研究表明，PD-L1 的CPS≥1 分或≥10 分的胃癌患者也能从帕博丽珠单抗的治疗中获益[13]。一项Ⅲ期多中心随机对照研究（Checkmate 649）首次报道了纳武利尤单抗（“O”药）联合化疗一线用于晚期胃癌、胃食管交界癌及食管癌[5]。该研究共纳入1 581 例患者，结果显示“O”药联合化疗可以改善患者的总生存期（overall survival，OS）和无进展生存期 （progression-free survival，PFS），且对于PD-L1 的 CPS≥5 分患者的OS 和PFS有显著提高［（OS：14.4 个月vs.11.1 个月，HR=0.71；P＜0.001），（PFS：7.7 个月vs.6.05 个月，HR=0.68；P＜0.000 1）］。进一步行PD-L1 的 CPS 临界值与OS 分析显示，PD-L1 的CPS 临界值越高，OS 和PFS获益越明显，即PD-L1 的 CPS 临界值为5 分时具有显著性差异（P=0.010 7），而临界值为1 分时无显著性差异（P=0.204 1）。此外，与单纯化疗相比，联合治疗可以降低PD-L1 的CPS≥5 分患者在治疗期间症状恶化的风险（HR=0.64，95%CI：0.49～0.83）。该研究还表明，“O”药联合化疗可能成为晚期胃癌、胃食管交界癌及食管癌的一线治疗方案。此外，一项关于胃癌免疫治疗相关的Meta 分析显示， 6 488 例患者PD-L1的临界值分析表明，单药免疫治疗可延长PD-L1 的CPS≥1 分患者的OS（HR=0.84，95%CI：0.74～0.96）；联合免疫治疗可使PD-L1 的CPS≥1 分患者的OS（HR=0.81，95%CI：0.71～0.92）和PFS（HR=0.77，95%CI：0.69～0.86）显著延长[14]。在食管癌和胃癌的治疗中，PD-L1 的表达有很大的潜力成为免疫治疗的有效生物标志物[5，14]。但是目前的探索仍存在一定的不足，对PD-L1 的 CPS 评分的临界值仍需要进一步深入研究。

在肝癌治疗方面，免疫抑制剂改变了肝癌的治疗状况。如KNYNOTE-240研究表明，PD-L1 表达与抗PD-1 治 疗 的 客 观 缓 解 率 （objective response rate，ORR）和PFS 之间具有显著相关性[15]。目前研究显示，帕博丽珠单抗作为PD-L1 阳性的肝细胞肝癌患者的二线治疗是有益的。但和其他实体肿瘤一样，免疫抑制剂单药治疗的应答率在肝细胞肝癌中依然较低。2021 年CheckMate 040 研究的随访数据显示，使用纳武单抗联合阿特珠单抗治疗有较好的ORR 并获得持续缓解[16]。而KEYNOTE-224 研究的ORR 仅为17%[17]。因此，包括不同的免疫抑制剂、免疫抑制剂+靶向药、免疫抑制剂+手术/射频消融/经导管动脉栓塞化疗等多种联合治疗方式为肝癌的治疗提供了多种选择。

目前，PD-L1 阳性的肿瘤对免疫抑制剂的敏感性及部分PD-L1 高表达和低表达的肿瘤对免疫抑制剂的疗效差异仍存在争议。值得注意的是，接受不同的PD-1 抑制剂治疗时会有不同的免疫治疗疗效。评估方法的多样性、病理医师的主观性以及PD-L1 最佳检验分界值的非标准化等均易导致分歧，并影响PDL1 预测作用的准确性和可重复性。目前的临床研究大多选择CPS 为 5 分 或者10 分作为分界值，并未涵盖所有类型的肿瘤，因此未来的研究应进一步对 PD-L1阳性的检测值进行具体的量化。

2 TMB 表达水平及其预测作用

近年来，TMB 已经发展成为免疫治疗中的一种新兴生物标志物，尤其在评估药物疗效和预测疾病预后方面有重要意义。目前，已有相关研究证明在如非小细胞肺癌、黑色素瘤和尿路上皮癌等类型肿瘤中，TMB 的水平与临床结果相关。因高水平TMB与免疫治疗较佳的OS 率呈正相关，与化疗相比，免疫治疗更推荐用于TMB 高表达的肿瘤[18]。同时，在涉及多种类型肿瘤的KEYNOTE 158 研究中，TMB 高表达（TMB 突变率 10/Mb）患者的单药帕博丽珠单抗治疗的ORR 为29%，因此帕博丽珠单抗被美国食品药品监督管理局（FDA）推荐用于伴有TMB 高表达的不可切除或转移性实体瘤[19]。

TMB 已被广泛应用于预测非小细胞肺癌和黑色素瘤免疫治疗的疗效，但鲜有研究强调TMB 在消化系统肿瘤的预测作用。Kim 等[20]对55 例使用PD-1抑制剂的胃癌患者分析显示，TMB 水平与免疫治疗的疗效相关，在胃癌中率先发现了TMB 水平与免疫治疗疗效的潜在相关性。此后，Guo 等[21]对晚期胃癌高TMB 组和低TMB 组患者免疫治疗的疗效进行深入分析，进一步证明高TMB 水平的晚期胃癌患者有更好的预后，通过检测患者的TMB，可以了解患者对免疫治疗的反应，以便更好地指导免疫治疗。2019 年的一项探索研究表明，对于包含MSI 或者错配修复（mismatch repair，MMR）缺失的结直肠癌，TMB 可以更好的识别对免疫治疗无效的患者。2020 年ASCO会议报道了KEYNOTE 061 试验，其主要研究TMB和PD-L1 表达之间的关系。该研究表明，对于高TMB 水平（即TMB＞175）患者，帕博丽珠单抗疗效优于紫杉醇，TMB 和PD-L1 之间无显著性相关[22]。因此，TMB 可以考虑为独立于PD-L1 的另一个有前景的生物标志物。但新抗原的鉴别、不同的TMB 算法及众多影响TMB 的因素，均对TMB 作为生物标志物的研究探索有一定的影响。因此，在检测TMB 水平时应权衡多种基于TMB 的各种生物标志物以减少相关影响并进一步提高准确性。此外，目前研究大多为小样本，且不同类型肿瘤所定义的TMB 高水平与低水平的检验临界值有显著性差异，未来需要大规模的Ⅲ期临床试验来证实TMB 的预测作用，并为特定的肿瘤确定检验临界值。

3 MSI 及其预测作用

高微卫星不稳定性（MSI-high，MSI-H）或错配修复缺陷（mismatch repair deficient，dMMR）常发生在多种类型肿瘤中，如子宫内膜癌、结直肠癌、胃癌及肝癌等[23-24]。相关证据表明，MSI-H 型结直肠癌（尤其是Ⅱ期）及子宫内膜癌的预后优于微卫星稳定（microsatellite stability，MSS）型，但在其他肿瘤中的作用尚不清楚[24]。2020 年，帕博丽珠单抗被中国国家药监局批准作为MSI-H 或dMMR 转移性结直肠癌的一线治疗，MSI 的重要性大幅提高。

2015 年，KEYNOTE 016 研究结果使FDA 批准帕博丽珠单抗用于含有MSI-H/dMMR 的实体肿瘤和常规化疗失败的晚期结直肠癌[25]。2019 年ASCO 会议上，一项涉及4 项随机试验（MAGIC 研究、CLASSIC研究、ARTIST 研究及ITACA-S 研究）的大型Meta分析讨论了不可切除胃癌中MSI 状态的预测价值[26]。该研究共纳入1 552 例患者，其中7.8%被诊断为MSI，与MSS 型亚组相比，MSI 型亚组有更好的5 年ORR（77.4%vs.59.2%，HR=0.50；P＜0.01）和5 年无疾病生存期（71.8%vs.52.3%，HR=0.50；P＜0.001）。该研究表明MSI-H 的存在通常代表胃癌良好的治疗效果，MSI 是无病生存期（HR=0.48，95%CI：0.33～0.70；P＜0.001） 和 OS（ HR=0.48， 95%CI： 0.29～0.81；P＜0.005）的独立相关因素。因此，MSI 是预测良好预后的一个独立因素，也是患者识别和筛选的一个特定因素。2020 年ASCO 会议关于KEYNOTE 177 和CheckMate 142 等 研 究 结 果 显 示[23，27]， MSI-H/dMMR（+）结直肠癌患者可以从免疫治疗中获益，因而FDA 批准纳武单抗用于MSI-H/dMMR（+）结直肠癌的治疗。

Pietrantonio 等[28]对2 545 例MSI 状态可评估的患者进行了荟萃分析，其结果表明免疫治疗可以提高MSI-H 肿瘤患者的OS（HR=0.34，95%CI：0.21～0.54），而MSI 稳定者HR 为0.85（95%CI：0.71～1.00），两个亚组之间的治疗效果有显著性差异（P=0.003）。该研究 中 的MSI-H患 者PFS 的HR 为0.57（ 95%CI：0.33～0.97），且对治疗反应的比值比为1.76（95%CI：1.10～2.83；P=0.02）。总之，MSI 状态对胃癌和结直肠癌的免疫治疗能够起一定预测作用。但MSI 尚不能完全适用于所有类型的消化系统肿瘤，如肝癌患者中MSI-H 的发生率仅2%，肝癌患者对帕博丽珠单抗治疗尚未显示出优越性。因此，MSI 可能不是肝癌免疫治疗可用的生物标志物。

4 ctDNA 及其预测作用

血清ctDNA 主要由肿瘤细胞凋亡、坏死或主动分泌释放的基因组DNA 片段组成，理论上所有的肿瘤细胞均产生ctDNA。ctDNA 可以检测到从点突变到结构乃至染色体拷贝数变异等遗传变异信息，以利于对肿瘤进行早期诊断和监测晚期复发[29]。同时，外周血中的ctDNA 可能比侵入性手段更能反应肿瘤内部特征，如肿瘤固有的异质性和整个基因变异，因此ctDNA 极大可能成为实体肿瘤治疗前后的生物标志物[30-31]。

随着现有治疗模式向个体化和精准化治疗转变，ctDNA 较传统的组织活检更有优势。1）ctDNA 为非侵入性检测，在样本不足时，对样本的数量和质量要求低。ctDNA 较短的半衰期使其对疾病进展进行动态检测更具说服力。2）ctDNA 评估有利于肿瘤的早期筛查和监测复发，而组织活检只有在病变迅速增长后才能发现。因此，ctDNA 具有无创、动态实时监测、全面分析及早期预测等优势。2020 年ASCO 会议上报道，ctDNA 在治疗过程早期出现也预示着肿瘤的进展，且ctDNA 在9 周内清除的患者比未清除患者有更好的PFS（12.3 个月vs.3.9 个月）。此外，2020 年ESMO 会议上CALIBRATION 试验表明ctDNA 的变化可以预测度伐利尤单抗在晚期食管癌中的相关疗效。有研究发现，胃癌患者使用免疫检查点抑制剂治疗后，血液中未检测到ctDNA 较检测到ctDNA 的患者有更好的中位PFS（7.4vs.4.9 个月，P=0.025）[32]。上述研究均表明ctDNA 在相关肿瘤的检测、疗效评估等方面极具前景。但由于缺乏大样本临床研究，ctDNA 的临床应用仍然面临着巨大的挑战。

总之，ctDNA 通过液体活检有利于胃癌、肝癌及结直肠癌等疾病的早期诊断、评估疗效和预后，且具有微创、方便等特点，因而成为组织活检的重要补充。目前，已有学者着力于探索ctDNA 与免疫治疗反应的相关性[33]。未来ctDNA 有望成为肿瘤化疗前后的标志物，但与免疫治疗的相关性证据仍不够可靠，因此其临床推广需要更多大样本和精心设计的试验研究，并不断优化ctDNA 检测手段。

5 结语与展望

PD-L1 表达在食管癌和胃癌免疫治疗中的价值已被证实[5]，但在结直肠癌中PD-L1 预测性较低。与PD-L1 相比，MSI-H/dMMR 可更好地反映胃肠道肿瘤免疫治疗的相关反应。但在肝细胞肝癌中，尚缺乏合适的生物标志物。TMB、ctDNA 及肿瘤浸润淋巴细胞更有可能成为可以预测多种类型肿瘤临床疗效的生物标志物。目前，已有多种新的生物标志物逐渐被学者关注，如CDK12、肿瘤浸润淋巴细胞、肠道微生物群、肿瘤相关外泌体等[34-35]。总之，PD-L1 和MSI状态作为生物标志物预测免疫治疗的反应前景较好，但实际仍存在较多问题。未来，应该进一步规范现有生物标志物的检测程序并不断探索更多有预测作用的生物标志物，联合利用多种生物标志物以更好的预测免疫检查点抑制剂的治疗疗效，以区分免疫治疗有应答和无应答者，发挥生物标志物的最大价值，以实现个体化、精准化治疗。