播散肿瘤细胞的休眠与存活机制及其在防治实体瘤转移中的作用

阙祖俊，席志超，徐宏喜，田建辉

0 引言

癌症是全球第二大疾病死因，每年约有1 000万人死于癌症[1]。尽管在癌症的诊断和治疗方面已经取得了长足的进展，但是癌症的转移问题仍然没有得到解决，大约90%的癌症患者死于转移性疾病进展[2]。因此，阐明与癌症转移相关的分子机制有助于改善转移性疾病患者的治疗效果。

随着早期诊断技术的快速发展和早期筛查如PET-CT在临床上的推广与应用，促使早期癌症确诊患者的比例逐年升高[3]。为防止转移，这些患者常规进行根治性手术，以获得最佳的疾病控制。然而，仍约有40%的患者在术后会发生复发或转移，且这些患者的5年生存率约为60%（肺癌）[1]。大量临床研究表明，现有的治疗手段对于肺癌早期术后患者的远期疗效往往获益有限[4-5]。一个重要原因是患者在临床确诊前肿瘤细胞的播散已经发生[6]，在部分患者的外周血、骨髓和淋巴结中均可检测到肿瘤细胞[7]，提示远处靶器官中也可能已经存在播散的肿瘤细胞，只是受限于现有临床检查技术而无法在活体内被发现，故阻断原发性肿瘤扩散的转移防治临床研究均未获得满意疗效，如基质金属蛋白酶（MMP）抑制剂、Cilengitide（靶向血管生成）、Dasatinib（靶向SRC）和Saracatinib（靶向BCR-ABL1）等抗转移药物[8-10]。

播散肿瘤细胞（disseminated tumor cells,DTCs）是指从原发灶脱落，在血管或淋巴管中循环的肿瘤细胞到达远处靶器官后，定植、存活下来的肿瘤细胞。研究发现DTCs在化疗和分子靶向治疗后仍能存活，并以休眠的状态长期潜伏在患者体内[11]。当这些DTCs从休眠激活为增殖状态，并增殖至影像学可检出的肿瘤病灶，此时才是临床上判断转移是否发生、确定患者临床分期和治疗方案的标准。然而目前临床上仍缺乏针对休眠DTCs形成转移灶这一阶段的有效治疗方案。因此，揭示DTCs的休眠与存活机制，并以DTCs作为转移干预的重要靶点，将有望改善肿瘤转移防治的疗效。本文就DTCs的休眠与存活机制及其干预策略的研究进展进行综述。

1 靶器官中DTCs的休眠与存活机制

外周血中的肿瘤细胞外渗侵入远处靶器官后，由于受到微环境、免疫监视、血管生成等因素的影响，其中大部分的DTCs会发生凋亡，仅有部分DTCs得以存活[12]。在靶器官中存活下来的DTCs可能立即生长为明显的转移灶，或以休眠、低增殖的形式潜伏在患者体内[7]。目前尚无法确定远处靶器官（骨髓除外）中DTCs的休眠或增殖状态，仅可通过检测骨髓中的DTCs的休眠或增殖状态来推测远处靶器官中的DTCs的休眠或增殖状态。由于DTCs所处的微环境不同，其增殖状态也存在很大的差异。Harper等研究发现乳腺癌细胞早期播散到远处靶器官骨髓和肺脏后，经过一段时间的休眠，在肺部发现的DTCs增殖后形成转移性肿瘤，而在骨髓中检测到的DTCs在整个实验期间仍保持休眠状态[13]。此外，有证据表明休眠的DTCs对常规疗法（化疗、靶向治疗等）具有抵抗力，且低表达肿瘤相关或特异性抗原、NK细胞活化配体等，从而有利于其逃避免疫系统的识别和杀伤[11]。因此，DTCs的休眠对于其在靶器官中定植和存活具有重要意义。

1.1 靶器官中DTCs的休眠机制

靶器官中DTCs的休眠是为了适应新的微环境，细胞经过一系列分子调控而进入可逆性的周期阻滞状态，为静止期肿瘤细胞（quiescent cancer cells,QCCs）的一种。微环境对DTCs休眠的影响主要通过整合素信号通路。研究发现整合素β1在诱导肿瘤细胞休眠中起着重要作用，下调整合素β1的表达可诱导肿瘤细胞由增殖状态向静止期状态转变[14]。与此同时，DTCs的休眠还受到细胞外基质（ECM）的调控，其主要通过抑制Wnt和Notch信号通路或激活BMP信号通路来诱导DTCs进入休眠状态[15]。此外，当受到应激信号或处于乏氧条件下DTCs也会进入休眠状态，其中MEKERK/MAPK和PI3K-Akt等信号通路在此过程中起着重要作用[13]。以上通路最终都直接作用于经典的细胞周期途径，通过上调p27和p21的表达，抑制Cyclin-CDKs复合物的形成，使DTCs进入休眠状态，即细胞周期阻滞在G0/1期[16]。肿瘤细胞休眠的一大特征是p38-MAPK增加，ERK1/2活性降低，p38-MAPKhigh/ERKlow表型现已被广泛用作DTCs休眠状态的标志[13]。

1.2 靶器官中DTCs的存活机制

DTCs进入休眠的先决条件是自身存活信号的增强。Ranganathan等研究发现应激诱导的p38激酶的激活导致内质网伴侣BiP的上调，通过激活ERK信号通路，诱导休眠的DTCs具有更高的存活率和治疗抗性[17]。研究还发现p38激酶可通过介导UPR的活化诱导内质网应激调节转录因子ATF6的表达，进而促进mTOR介导的休眠DTCs存活[18]。此外，在乳腺癌患者的骨髓中发现趋化因子CXCL12可通过Src基因上调Akt通路进而促进休眠的DTCs存活；而当DTCs处于乏氧和低葡萄糖的条件下，其可通过上调Grp78（一种UPR）蛋白来维持自身的生存[19]。

自噬可能是促进休眠DTCs存活的另一种生存机制，因为自噬在维持细胞内稳态中起着重要作用。研究发现自噬有助于延长DTCs的存活时间，其主要通过维持氨基酸水平、ATP生成和阻断能量突变来支持DTCs的存活[13]。值得注意的是，当DTCs异常黏附在ECM上时会诱导自噬，而自噬通过自噬相关蛋白7（ATG7）调控休眠的DTCs存活，当敲除ATG7基因后可有效的消除休眠的DTCs[20]。此外，研究发现肿瘤细胞播散到靶器官后具有很高的自噬通量，其中进入休眠的DTCs其自噬通量进一步增加，而进入增殖的DTCs其自噬通量降低，提示自噬是休眠DTCs生存的关键过程[20]。

2 靶向休眠DTCs防治实体瘤转移的治疗策略

传统抗肿瘤治疗药物主要以增殖活跃的肿瘤细胞作为靶细胞，在临床上取得了一定的疗效。针对休眠的DTCs临床上仍缺乏有效的干预药物和治疗手段，目前主要有三种治疗策略[16,21]，这些策略包括：（1）长期维持DTCs休眠，使癌症转变为慢性可控制的疾病；（2）激活休眠的DTCs，随后通过常规抗肿瘤治疗将其杀死；（3）开发可以杀死休眠DTCs的治疗药物。其中，第一种策略仍存在休眠的DTCs增殖激活后形成转移的风险；第二种策略激活休眠的DTCs增殖可能会涉及诱发DTCs中对治疗无反应的细胞亚群扩增，进而使原本无疾病症状的患者加速转移进展；第三种策略是直接靶向根除休眠状态的DTCs，这可能是预防肿瘤转移最有效的治疗策略。

2.1 维持DTCs休眠

首先，DTCs的休眠可以通过抑制增殖信号、激活休眠通路或营造休眠的环境来维持。如抑制uPAR信号、整合素β1信号、ERK和Src激酶的活性等，可以诱导DTCs进入休眠状态[14,22]。DTCs的休眠也可以通过上调休眠因子的表达来维持，包括p38/MAPK、DYRK1A和NR2F1等[23-24]。此外，赋予转移前休眠龛的成分，例如GAS6、BMP4、BMP7和TGF-β2等，也可使DTCs保持休眠[25-26]。已有研究发现ERK抑制剂U0126或Src抑制剂PP1可有效维持播散性乳腺癌细胞的休眠[27]。而HDAC抑制剂（伏立诺司他、帕诺比诺司他、贝立诺司他和罗米肽）或DNA去甲基化药物可用于维持DTCs长期休眠的替代辅助治疗药物，如5-氮胞苷（5-AzaC）和全反式维甲酸（atRA）联合使用时可长期维持骨髓中的DTCs处于休眠状态[11,28]。以上这些方法的缺点是不能杀死休眠的癌细胞，其临床结果是需要接受终生治疗，这对患者的依从性、成本和药物毒性等方面提出了挑战。

2.2 诱导休眠的DTCs凋亡

揭示休眠DTCs的存活机制并进行靶向阻断可能对其根除具有一定作用。在休眠的乳腺癌细胞中，Src激酶活性是维持其休眠所必需的，而ERK1/2的活性是休眠向增殖转变的关键[29]。研究发现用Src抑制剂AZD0530单独给药时可阻止休眠的癌细胞增殖，而将其与MEK1/2抑制剂AZD6244（MEK1/2是ERK1/2的上游激活剂）联合给药时可诱导休眠的癌细胞凋亡[30]。此外，Schewe等研究发现一种eIF2α磷酸酶抑制剂Salubrinal，不仅能增强硼替佐米对肿瘤细胞的杀伤作用，且还可诱导硼替佐米治疗后存活下来的静止期肿瘤细胞发生凋亡[18]。与此类似，在用EGFR抑制剂（厄洛替尼）治疗的非小细胞肺癌（NSCLC）异种移植瘤中，肿瘤细胞会进入静止状态，在这种治疗下存活下来的细胞最终在长时间的静止后会重新生长。但是，当厄洛替尼与ABT-737（一种BCL-2和BCL-XL抑制剂）联合使用时，静止期的肿瘤细胞会消失[31]。以上研究提示有效根除休眠的DTCs需要同时抑制维持休眠的生存途径和逃离休眠的途径。

抑制自噬也可诱导休眠的DTCs凋亡。Gupta等研究发现伊马替尼（PDGFRA抑制剂）治疗胃肠道间质瘤（GIST）后存活下来的静止期癌细胞高度依赖自噬，而采用自噬抑制剂和伊马替尼联合治疗时可显示减少体内外休眠的GIST数量[32]。此外，Vera-Ramirez等研究发现采用自噬抑制剂（氢氯喹、3-甲基腺嘌呤或巴非霉素）或敲除ATG7基因抑制自噬都可显著降低休眠乳腺癌细胞的存活[20]。由于自噬抑制剂不能有效地消除进入细胞周期的细胞，因此这种作用仅针对处于休眠状态的DTCs。然而，相比现有的治疗，上述方法的主要问题是根除休眠DTCs效果的不确定性，因为现有可用的诊断工具无法检测到单个休眠细胞，且无法评估该疗法对患者的疗效。

3 展望

尽管早期筛查和诊断显著改善了癌症患者的生存期，但许多接受手术治疗的患者最终发展为远处转移并因此死亡。辅助治疗的疗效取决于其清除已播散的肿瘤细胞的能力，而由于远处靶器官中的播散肿瘤细胞为适应新的环境过程会进入休眠状态，这使其对辅助治疗产生抗药性，并经过一段长时间的休眠后，DTCs最终增殖为临床可检出的转移瘤。因此，休眠的DTCs作为抗肿瘤转移治疗的靶点越来越受到重视。由于休眠的DTCs严重依赖于增强其存活的信号通路，干扰这些通路可能会提高辅助治疗的疗效。此外，揭示DTCs的休眠和再激活机制还可提供额外的治疗靶点。迄今为止，治疗休眠DTCs的最佳方法在临床上仍未找到答案。因为缺乏临床前休眠模型和能够检测休眠DTCs的敏感诊断和成像工具。

为此，我们课题组建立了可部分模拟肿瘤细胞休眠的体内与体外研究模型，其中包括营养剥夺、乏氧诱导和接触抑制模型[33-34]以及3D悬浮培养模型，发现处于悬浮状态的肿瘤细胞可自发的聚集成簇，且具有休眠的特性。而将处于休眠状态的肿瘤细胞接种到小鼠体内，即可建立具有休眠特征的DTCs研究模型。此外，基于我们建立的休眠肿瘤细胞研究模型，通过高通量筛选，发现藤黄属植物中Guttiferone K、Garoliganthone C等化合物具有靶向杀伤休眠肿瘤细胞的作用[35-36]，提示其可能对休眠的DTCs也具有细胞毒作用，但仍有待进一步研究。总之，深入研究休眠的DTCs在肿瘤转移中的作用及机制，并以此寻找到可诱导休眠的DTCs凋亡的靶点和治疗药物，这可能对防治肿瘤转移，提高临床疗效具有重大的意义。